口蹄疫病毒3ABC單抗阻斷ELISA抗體檢測方法應用

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(光明牧業有限公司 200436)

根據新型口蹄疫疫苗生產工藝，用滅活疫苗免疫的動物不會產生病毒非結構蛋白3ABC抗體。因此，采用口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC單抗阻斷ELISA試驗，可以區分免疫抗體與自然感染抗體。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 隨機抽取基地牧場3-4月齡經過口蹄疫滅活三價疫苗免疫健康犢牛30-40頭。

1.1.2試驗試劑盒 采用中國農業科學院蘭州獸醫研究所口蹄疫病毒3ABC單抗阻斷ELISA抗體檢測試劑盒，批次：20160912129。

1.2實驗步驟

1.2.1試劑盒準備 試劑盒放置室溫恒溫1-2 h。

1.2.2試劑準備 PBST洗滌液按試劑盒說明書進行配制1∶25倍稀釋。

1.2.3加入血樣 在捕獲3ABC抗原酶標板每孔中加入80 μL血清稀釋液，然后依次加入20 μL陰、弱陽性、陽性對照血清各平行2孔、血清樣品各一孔，混勻，封上封口膜，蓋上板蓋，室溫(18-25℃)反應20 h。

1.2.4洗板 用PBST稀釋液連續洗滌5次，在吸水紙上拍干。

1.2.5加酶標單克隆抗體 用血清稀釋液1∶100比例稀釋酶標單克隆抗體，每孔加入100 μL，封口膜封口，室溫(18-25℃)孵育60 min。

1.2.6洗酶標板 用PBST稀釋液連續洗酶標板5次，在吸水紙上甩干。

1.2.7加底物溶液 每孔加入100 μL底物溶液，封口膜封口，室溫(18-25℃)避光作用12 min，在酶標儀上讀取OD630值，并控制在0.5-0.6之間。

1.2.8加終止液 每孔加入100 μL終止液，輕輕震蕩混勻，在酶標儀上讀取D450 nm吸光值。

1.2.9結果計算 1)計算陰性、弱陽性、陽性對照血清平均OD450值。2) 計算阻斷率公式PI=(1-測試樣品OD450值/陰性對照平均OD450值)×100%。

1.2.10實驗結果判定 1)實驗成立條件：陰性對照平均OD450值>1.0；弱陽性對照血清阻斷率>50%，陽性對照血清阻斷率>70%。2)結果判定標準：血清樣品PI值≥50%，判為非結構蛋白抗體陽性；血清樣品PI值<50%，判為陰性。

2 實驗結果

口蹄疫病毒3ABC抗體檢出率見表1。

表1 口蹄疫病毒3ABC抗體檢出率

3 分析

本實驗采用基于兩種單克隆抗體(Mab)的口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗體阻斷ELISA方法監測，自2016年11月起至2017年5月結束，樣品2063份，檢出率平均值為0.82%。根據免疫登記信息，3ABC陽性抗體犢牛都已經口蹄疫三價苗免疫，結合后期臨床診斷，陽性犢牛無感染口蹄疫病毒癥狀產生，體況健康，判為假陽性。有文獻資料顯示如使用了抗原純化度不高的口蹄疫三價苗，會出現3ABC假性抗體，建議牧場在疫苗使用上盡量選擇抗原純化度較高的口蹄疫疫苗，避免假陽性的產生。