乙醇法提取金銀花總黃酮工藝研究

張 君, 朱金艷，祝 軍

(1.沈陽食品檢驗所，遼寧 沈陽 110136；2.莊河市食品檢驗監測中心， 遼寧 莊河 116400)

黃酮類化合物是天然產物，主要存在于植物中，許多藥材的有效成分均為黃酮。總黃酮可以改善人體的血液循環，降低人體膽固醇含量，降低心腦血管疾病的發生。它還是一種很強的抗氧劑，可有效清除體內的自由基，可以阻止細胞的退化、衰老，也可阻止癌癥的發生，其藥理作用以引起重視。隨著社會進步和對健康的追求，研究總黃酮類物質取得了一定進步，通過進一步研究，可以發揮其更大的作用，創造更多的機遇，使其在諸多領域發揮重要作用。

本試驗采用乙醇法來提取總黃酮類物質，并通過總黃酮類物質的定性鑒定(顏色反應)，確定有機溶劑提取液含有黃酮類物質。再利用單因素通過了不同的提取溫度、乙醇濃度、時間、液固比等條件對金銀花總黃酮提取率的影響，并通過正交試驗設計，對乙醇法提取金銀花中黃酮類物質的工藝參數進行優化，為企業規模化生產金銀花總黃酮提供理論依據，以達到更加充分、合理的利用金銀花資源提高金銀花附加值的目的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設備

1.1.1 材料 市售金銀花。

1.1.2 試劑 蘆丁標準樣品；90%乙醇、濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鋅粉、硼酸等均為分析純。

1.1.3 儀器設備 TU-1810紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；RE-5299旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；AL204-IC電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃酮的提取工藝流程 金銀花→烘干→粉碎篩選→配制溶液→恒溫提取→離心分離→蒸發濃縮。

1.2.2 金銀花總黃酮含量測定 (1)蘆丁標準溶液的制備。準確稱取11.2毫克蘆丁標準品，用90%乙醇溶解，定容至50毫升容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.4毫升，搖勻；放置60分鐘后加入4%氫氧化鈉溶液4毫升，搖勻；最后用60%的乙醇定容，15分鐘后與420納米處測定吸光值。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。(2)制作金銀花總黃酮濃度標準曲線。取10.0毫升蘆丁標準溶液置于50毫升比色管中，加入亞硝酸鈉溶液（5%）2毫升，搖勻，并靜置7分鐘，再加入硝酸鋁溶液（5%）2毫升，搖勻，再靜置7分鐘，加入氫氧化鈉溶液（10%）5毫升，以無水乙醇定容至刻度，混勻，靜置20分鐘。以空白試劑為零點，在420nm波長的范圍內測定吸光度。準確吸取標準使用液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00毫升分別置于25毫升比色管中，按照上述步驟顯色，以空白調零點，在420納米處測定吸光度。

1.2.3 金銀花總黃酮的定性鑒定 量取金銀花黃酮提取液80毫升于蒸發儀內濃縮至8毫升，備用。(1)鹽酸—鋅粉反應。取2毫升樣品置于試管中，加少量鋅粉，搖勻后，滴加數滴鹽酸，當溶液呈粉紅色時證明提取液中含有黃酮類物質。(2)硼酸反應。取2毫升樣品濃縮液放于試管內，加入少許5%硼酸溶液，搖晃，當溶液無反應時證明提取液中含有黃酮類物質。(3)氫氧化鈉反應。取2毫升樣品濃縮液放于試管內，加入少許氫氧化鈉，搖晃，當溶液呈黃色時證明提取液中含有黃酮類物質。(4)濃硫酸反應。取2毫升樣品濃縮液放于試管內，加入少許濃硫酸，搖晃，當溶液呈橙紅色時證明提取液中含有黃酮類物質。

1.2.4 單因素試驗 (1)固液比對金銀花總黃酮提取率的影響。精確稱取10克金銀花于回流瓶中，分別按1∶15、1∶17、1∶19、1∶21、1∶23的固液比加入70%的乙醇中，于65℃回流3小時。相同條件提取兩次，然后將兩次濾液合并，蒸發濃縮至100毫升，測定并計算樣品液中總黃酮含量。重復三次取平均值。(2)溫度對金銀花總黃酮提取率的影響。精確稱取10克金銀花于回流瓶中，以70%乙醇為提取劑，固液比為1∶19，分別在55、60、65、70、75℃回流3小時。常溫放置冷卻后過濾，濾渣于相同條件下重復提取1次，然后將兩次濾液合并，蒸發濃縮至100毫升，測定并計算樣品液中總黃酮含量。重復3次取平均值。(3)時間對金銀花總黃酮提取率的影響。精確稱取10克金銀花于回流瓶中，以70%乙醇為提取劑，固液比為1∶19，在65℃分別回流1、2、3、4、5小時。相同條件提取兩次，然后將兩次濾液合并，蒸發濃縮至100毫升，測定并計算樣品液中總黃酮含量。重復3次取平均值。(4)乙醇濃度對金銀花總黃酮提取率的影響。精精確稱取10克金銀花于回流瓶中，以固液比為1∶19，在65℃分別分別放于乙醇體積分數為50%、60%、70%、80%、90%回流3小時，放置冷卻后過濾，濾渣在此條件下重復提取1次，然后將兩次濾液合并，蒸濃縮至100毫升，測定并計算樣品液中總黃酮含量。重復3次取平均值。

1.2.5 正交試驗提取工藝優化 在乙醇法提取金銀花黃酮過程中，對液固比、乙醇體積分數、提取時間、提取溫度等影響因素進行正交試驗。

1.2.6 金銀花總黃酮的測定及含量計算 準確稱取10毫升的金銀花有機提取液置于50毫升容量瓶中，按蘆丁顯色標準方法測定金銀花提取液在420納米處測定吸光度，計算金銀花提取物中總黃酮的含量。

2 結果與分析

2.1 總黃酮標準工作曲線

以蘆丁標準溶液濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制總黃酮標準工作曲線（見圖1），得回歸方程：Y=10.88X+0.0073，相關系數R2=0.996。結果表明，總黃酮含量在該范圍內與吸光度線性良好。

圖1 黃酮的標準曲線及其回歸方程

2.2 金銀花總黃酮的顏色反應

依據總黃酮的定性鑒定方法，含有黃酮類的物質在與鹽酸—鋅粉、硼酸溶液、氫氧化鈉溶液、濃硫酸中反應，應分別顯粉紅色、無反應、黃色、橙紅色(表1)。本試驗金銀花提取液的顏色反應結果與定性鑒定的顏色反應結果一致，確認金銀花—乙醇的濃縮提取液中含有黃酮類物質。

2.3 單因素試驗結果分析

由單因素試驗結果分析發現各因素對金銀花總黃酮含量影響程度不同。

2.3.1 固液比對金銀花總黃酮提取率結果分析 由表2可知，固液比對金銀花總黃酮提取率的影響，當用70%乙醇為有機溶劑提取金銀花總黃酮時：隨著固液比的增加，金銀花中總黃酮的提取率先增加后下降，當固液比在1∶19時，金銀花中總黃酮的提取率最佳，所以在該試驗條件下固液比1∶19最為合適。

2.3.2 溫度對金銀花總黃酮提取率結果分析

提取溫度對黃酮得率的影響如表3，在該試驗條件下溫度對金銀花總黃酮的提取率先增加后減少，在65℃時金銀花中總黃酮的提取率最高。

2.3.3 時間對金銀花總黃酮提取率結果分析

其他條件不變的情況下，提取時間對金銀花總黃酮提取率的影響結果見表4，提取時間在0～3小時時提取液中總黃酮類物質的濃度隨時間增加而升高，在3小時時達到最高，即使增加時間濃度也不會提高，所以3小時是最佳的提取時間。

2.3.4 乙醇濃度對金銀花總黃酮提取率結果分析 乙醇濃度對金銀花總黃酮提取率的結果如表5，體積分數在70%之內隨分數增加而增加，在70%達到最大濃度3.55%，體積分數超過70%以后即使增加濃度提取率也不會增加，所以在該試驗條件下70%乙醇體積分數為最佳體積分數。

表1 黃酮定性鑒定結果

表2 固液比對金銀花總黃酮提取率結果

表3 溫度對金銀花總黃酮提取率的結果

表4 時間對金銀花總黃酮提取率的結果

表5 乙醇濃度對金銀花總黃酮提取率的結果

表6 正交試驗因素水平

表7 金銀花總黃酮提取率正交試驗結果

2.4 正交試驗結果與分析

本試驗對液固比A、乙醇濃度B、時間C、溫度D均不同的正交試驗，見表6和表7。

由表7正交試驗結果可知，各種因素對金銀花總黃酮含量提取率影響程度依次為A＞B＞C＞D。依實驗結果可看出，溶劑越多，提取率越高，但由于結果相近，越多的溶劑會造成資源的大量浪費。提取時間對提取率也有一定的影響，時間過短提取不充分，時間過長使得提取周期延長，而且長期處于高溫狀態可能造成黃酮被高溫破壞，反而降低黃酮的提取率。所以由表分析結果中數據4種因素水平在A2、B2、C3、D1組合時為最佳提取條件，在該條件下提取液中黃酮含量最高，黃酮含量達到3.55%。

3 結論與討論

用乙醇提取金銀花總黃酮最佳提取條件為，固液比1∶19，乙醇體積分數70%，提取時間為3小時，提取溫度為65℃，在該工藝條件下金銀花黃酮含量為3.55%。在這些條件下，該有機溶劑提取工藝最優化，費用最低，提取溶劑使用量最少，提取物易收集，無污染，可實現工廠化生產，是提取金銀花總黃酮的一種非常有效的方法。

目前對黃酮提取的研究基本技術有3種：水提法；溶劑提取法；超聲波輔助法。如何將幾種簡單的方法配合使用獲得更高的提取率是未來金銀花黃酮類物質提取的研究方向。