毛細管電泳法測定不同體細胞數的原料乳的蛋白組成及含量

張 明,任發政,方 冰,張 昊,郭慧媛

(1.北京工商大學食品學院,北京 100048；2.中國農業大學北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京 100083；3.中國農業大學,食品科學與營養工程學院,教育部北京市共建功能乳品重點實驗室,北京100083;4.河北省畜產食品工程技術中心，河北三河 065200)

原料乳中含有少量體細胞,包括巨噬細胞(35%～79%),淋巴細胞(16%～28%),多形核中性白細胞(3%～26%)和乳腺組織脫落的上皮細胞(2%～15%)[1-2]。體細胞數即每毫升乳中所含的體細胞總數，是衡量奶牛乳房健康狀況和原料乳品質的一項重要指標。

體細胞數量(Somatic Cell Count,SCC)的高低對原料乳蛋白質組成和含量有明顯影響。由于來自血液中的白細胞中包含了多種蛋白水解酶,如組織蛋白酶B、C、D及L等[3],直接導致乳中乳清蛋白和酪蛋白含量的劇烈變化。而蛋白質組分的變化也直接影響到原料乳的加工特性。研究表明,原料乳中SSC的增加會導致干酪產量的降低,延長凝乳時間,降低凝乳穩定性;原料乳的SSC的增加引發的酪蛋白水解反應會使得液態奶產生苦味[1]。因此,明確原料乳SCC數量與蛋白質含量組成之間的相互關系,對指導企業原料乳的收購至關重要[4-5]。然而,電泳法、高效液相色譜法等傳統蛋白分析方法普遍存在,但存在分離效率差、分辨率低等問題,無法對原料乳主要的蛋白質進行有效的分離和定量測定。

毛細管電泳是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術。牛乳中主要的蛋白組成[6],甚至乳清蛋白、乳球蛋白、酪蛋白及其重要降解產物para-κ-酪蛋白[7-9]均可經由毛細管區帶電泳方法鑒別。本研究首先建立了乳蛋白的毛細管電泳分析方法;并采集了不同SCC數量原料乳,分析不同SCC數量的原料乳蛋白質含量、組成的變化規律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料乳 來自北京三元集團綠荷渠頭牧場的32頭荷斯坦乳牛;α-乳白蛋白(α-La)、β-乳球蛋白(β-Lg)、α-酪蛋白(α-CN)、β-酪蛋白(β-CN)和κ-酪蛋白(κ-CN)標準品及二硫蘇糖醇 美國Sigma公司;尿素 純度大于99.5%,美國Amresco公司;大豆分離蛋白(純度大于90%) 河南正興食品添加劑有限公司;水解膠原蛋白(純度大于95%) 鄭州藍天生物科技有限公司。

FossMatic 5000體細胞分析測定儀 丹麥Foss公司;P/ACE MDQ毛細管電泳儀及未涂層毛細管柱 美國Beckman公司;低溫離心機 美國Thermo Scientific 公司;超純水儀 ELGA Lab Water公司;KH5200DB型超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司;精密酸度計 北京哈納科儀科技有限公司。

樣品緩沖液:40 mmol/L磷酸二氫鈉,0.1% DTT,6 mol/L尿素,用NaOH溶液調節pH至8.0,定容。用0.45 μm水系濾膜對配制好的溶液進行過濾,20 kHz超聲10 min,備用。

電泳緩沖液:20 mmol/L磷酸二氫鈉,0.05%羥丙基甲基纖維素,6 mol/L尿素,用磷酸溶液調節pH至2.75,定容。用0.45 μm水系濾膜對配制好的溶液進行過濾,20 kHz超聲10 min,備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料乳樣品的采集及制備 將待測牛乳樣品在4 ℃條件下4000 r/min離心20 min除去脂肪,取一定體積的下層脫脂乳,與樣品緩沖液按體積比1∶4混合,室溫放置1 h后用0.45 μm的水系濾膜過濾,備用。

1.2.2 原料乳的分類 利用體細胞分析測定儀測定每頭牛所產牛乳的體細胞數。根據測定結果,將原料乳按照體細胞數含量分為四組:小于3萬個/mL、20～25萬個/mL、55～60萬個/mL及100～130萬個/mL。

1.2.3 毛細管區帶電泳分離條件 參照文獻[10]，非涂層毛細管(60 cm×50 μm,有效長度:50 cm),羥丙基甲基纖維素為添加物,設置柱溫為35 ℃,紫外檢測波長為214 nm,選擇pH2.75的磷酸鹽緩沖液為樣品緩沖液及上樣緩沖液,壓力進樣方式為1.0 psi、10 s,分離電壓設為25 kV。

1.2.4 牛乳樣品及標準品的毛細管電泳測定 取處理好的牛乳樣品1 mL于進樣瓶中,按照優化好的電泳條件進行測定,每個樣品重復測定兩次。毛細管使用前的活化以及實驗過程中毛細管的清洗程序如下[8]。

毛細管使用前的活化程序:調節壓力至20 psi,先后用0.1 mol/L NaOH溶液、0.1 mol/L HCI溶液和超純水沖洗10、5和2 min。

樣品測定開始前,毛細管的沖洗程序為:調節壓力至70 psi,先后用超純水、0.1 mol/L NaOH溶液、超純水、電泳緩沖液分別沖洗1、2、2和5 min。

樣品測定結束后,毛細管的沖洗程序:調節壓力至70 psi,用0.1 mol/L NaOH溶液沖洗10 min,再調節壓力至50 psi,先后用0.1 mol/L HCI溶液和超純水沖洗10和2 min。

1.2.5 牛乳蛋白毛細管區帶電泳圖譜的建立 將實驗樣品按照優化好的電泳條件進行測定,得到各自的電泳圖譜,并按以下步驟對電泳圖譜進行處理:對獲得的一系列電泳圖譜進行評價并得到牛乳蛋白毛細管區帶電泳對照圖譜;選擇各譜圖中峰共有率不低于70%的作為確定指紋峰的依據;采用牛乳蛋白標準品對電泳圖譜中的主要乳清蛋白(α-乳白蛋白和β-乳球蛋白)和酪蛋白(α-、β-和κ-酪蛋白)進行標定;并結合已有的文獻報道[1,8],確定出這幾種蛋白峰之外的電泳峰所代表的乳蛋白種類。

2 結果與討論

2.1 牛乳蛋白標準曲線及方法評價

各牛乳蛋白標準品的毛細管電泳圖譜如圖1所示,五種牛乳的主要蛋白組分中,α-La、β-Lg和κ-CN純度較高,呈現單一主峰;而α-CN主要包含三個組分αs2-CN、αs1-CN及αs0-CN,根據產品標準品說明書及三種蛋白的性質分析,確定遷移時間15.6 min的成分為αs2-CN、遷移時間16.8 min的成分為αs1-CN,遷移時間17.5 min的成分為αs0-CN;β-CN主要包含三個組分β-CN B、βA1-CN和βA2-CN,根據產品標準品說明書及三種蛋白的性質分析,確定遷移時間18.5 min的成分為β-CN、遷移時間19.3 min的成分為βA1-CN,遷移時間20.3 min的成分為βA2-CN。隨后,原料乳的檢測也能夠清晰分辨以上9個主要的蛋白組分(圖1)。

圖1 牛乳蛋白標準品與原料乳的電泳圖譜Fig.1 Electrophoregrams of bovineprotein standards and raw milk注:1:α-La;2:β-Lg;3:αs2-CN;4:αs1-CN;5:αs0-CN;6:κ-CN;7:β-CN B;8:β A1-CN;9:β A2-CN,圖2同。

將不同濃度的乳蛋白標準品建立特征峰面積與濃度間的回歸方程,并進行重現性和回收率實驗,結果見表1。五種牛乳中主要蛋白組分的相對遷移時間及峰面積的相對標準偏差均小于5%,加標回收率均在88%～102%之間,表明方法的精密度和準確度較好。

表1 各蛋白標準品的回歸方程、相關系數、線性范圍及對應的重復性和回收率Table 1 The regression equation,correlation coefficient,linear range,repeatability and recovery of each protein standard

2.2 不同SSC原料乳的蛋白組成分析

2.2.1 不同SSC數量的原料乳的毛細管電泳分析 采集得到的不同SSC數量的原料乳的毛細管電泳譜圖見圖2。從圖2中可以看出,隨著SSC數量的增加,1～9號樣品峰的大小有不同程度的變化,尤其是β-CN(7號峰)和βA1-CN(8號峰)出現了顯著的下降;而且隨著SCC的提升,也有新電泳峰的出現,主要集中在3個遷移時間,分別為10～12 min(組分A)、15～16 min(組分B)和23～27 min(組分C),這些組分可能是由SSC所攜帶的plasmin等蛋白酶的水解作用生成[11]。

圖2 不同體細胞數原料乳樣品的電泳圖Fig.2 Electrophoregrams of raw milk with different somatic cell count

2.2.2 不同SSC數量的原料乳總蛋白含量變化 不同SSC的原料乳中總蛋白含量變化如圖3所示,分別用Foss乳成分及體細胞分析儀和毛細管區帶電泳譜圖中的峰面積來表征。常用的Foss乳成分及體細胞分析儀測定得到的總蛋白含量結果表明,不同SSC的原料乳間總蛋白含量并無顯著變化(p>0.05)。然而,用本文建立的毛細管區帶電泳法的結果表明,乳中總蛋白含量隨著SSC的增加有上升趨勢,當SSC增加到100萬個/mL以上時,開始有顯著性差異(p<0.05),這一結果與Santos等[1]的報道一致。

圖3 不同體細胞數的原料乳中總蛋白含量Fig.3 Total protein contents of raw milk with different somatic cell count

2.2.3 不同SSC數量的原料乳蛋白組成變化 不同SSC的原料乳的毛細管電泳譜圖中各特征峰對應的峰面積變化如表2所示。結合表2可知,隨著體細胞數的增加,β-CN B和βA1-CN兩種蛋白的相對含量顯著降低(p<0.05);α-La、αs2-CN和βA2-CN的相對含量沒有顯著性變化(p>0.05);β-Lg、αs1-CN、αs0-CN、κ-CN的相對含量顯著增加(p<0.05)。

表2 電泳圖中各組分峰占總峰面積的比例Table 2 The peak area proportions of each component in electrophoregrams

2.2.4 不同SSC數量的原料乳乳清蛋白和酪蛋白的比例的變化 乳清蛋白和酪蛋白的比例是決定原料乳加工方式的重要依據。根據圖2中各個蛋白組分的含量結果,分析了不同SCC數量的原料乳中乳清蛋白和酪蛋白的變化規律,結果如表3所示。隨著SSC的增加,主要乳清蛋白的含量呈上升趨勢,這與已有研究結果一致[3]。同時,酪蛋白占總蛋白的比例隨牛乳體細胞數的增加顯著降低,這是因為在高體細胞數牛乳中存在相應的蛋白水解酶,能將酪蛋白水解[1]。酪蛋白的水解及乳清蛋白的增加導致總酪蛋白與乳清蛋白的比例逐漸降低(表3),這一比值的改變不僅影響乳蛋白的結構,還會影響乳制品的宏觀物性如酸奶的凝膠質量等。研究指出,隨著酪蛋白與乳清蛋白比例的升高,酸奶凝膠的硬度和黏度均有所降低,酸奶的顆粒變粗糙。相同固形物含量的酸奶,隨著酪蛋白與乳清蛋白比例的降低,酸奶的硬度和持水力均有所增加[12]。

表3 主要乳清蛋白和總酪蛋白占總蛋白的比例Table 3 The proportions of the main whey protein and casein

3 結論

本文利用毛細管電泳法測定了不同SSC的原料乳的蛋白組成及含量,結果表明:當SSC增加到100萬個/mL以上時,總蛋白的含量才會顯著增加(p<0.05),但不同體細胞數的原料乳中,蛋白組分及含量均不同。隨著SSC的增加,α-乳白蛋白、αs2-酪蛋白和βA2-酪蛋白的含量無顯著差異(p>0.05),β-CN B和βA1-CN兩種蛋白的相對含量顯著降低(p<0.05),β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白、αs0-酪蛋白、κ-酪蛋白含量均顯著增加(p<0.05)。鑒于蛋白質種類及含量的變化均會引起后續加工環節的品質差異,本文建立的毛細管區帶電泳方法可以作為牛乳蛋白品質測定的一種快速、可靠的檢測方法,為后續加工環節的原料選擇提供依據。

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