植物乳桿菌微膠囊化研究

羅紅霞,李曉紅,田文靜,張 俊,王 建,林少華

(1.北京農業職業學院,北京 102442;2.江西農業大學,江西南昌 330045)

植物乳桿菌作為益生菌,對人類和動物健康有著重要的促進作用[1],如調節胃腸道生態平衡、增強免疫力、降低膽固醇高血壓和抑制腫瘤前體物質形成等功能[2-5]。目前,已廣泛應用于保健品、功能性食品、微生態添加劑等的研發和使用[6-7]。雖然植物乳桿菌的功效已經得到不少專家證實,但卻難以有足夠數量的活菌到達腸道而發揮作用。其主要原因是植物乳桿菌到達胃腸道消化系統后,受到胃酸、膽汁和其他一些消化酶等的影響而喪失活性[8-9]。

而微膠囊技術是提高乳酸菌存活率的一項高新技術[10-11],它能達到較好的緩釋效果[12],成為國內外研究的熱點。常用的微膠囊制備方法主要包括:噴霧干燥法、擠壓法、乳化法、凝聚法、流化床包埋空氣懸浮法和靜電法等[13-14]。噴霧干燥是在干燥室中將物料霧化,再利用熱空氣將物料中水分迅速汽化,得到干燥產品[15]。該方法具有成本低廉、適用性廣泛、生產效率高等優點,更適合工業化推廣應用[16-17]。韓冬冬等[18]利用噴霧干燥法對土壤石油中污染生物修復的革蘭氏陰性細菌進行微膠囊化后,菌的活性和穩定性得到有效提高。

蛋白質如小麥蛋白、牛奶蛋白、乳清蛋白和明膠常用作微膠囊的壁材[19-21]。乳清蛋白和明膠是在食品工業中被廣泛使用的材料,其來源廣泛,無毒無害,價格低廉,具有良好的生物相容性。

本實驗以乳清蛋白和明膠為復合壁材,利用噴霧干燥和生物微膠囊技術,將青貯飼料中優良植物乳桿菌進行包埋,并應用響應面法優化植物乳桿菌微膠囊工藝,以期提高該菌體在胃腸道消化系統中的存活率。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

菌種 采自河北省廊坊市固安縣天然發酵玉米青貯飼料;乳清蛋白(食品級)、明膠(分析純)、MRS液體培養基、MRS固體培養基、磷酸氫二鉀(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、胰蛋白酶(酶活力≥2500.0 U/mg) 北京化學試劑公司。

LDZF-30KB-II型高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;DNP-9082恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;普通光學顯微鏡55i 日本OYLMPUS;PHS-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠;DT502A電子天平 常熟市砝碼儀器有限公司;L-117型噴霧干燥器 北京來亨科貿有限責任公司;R134A離心機 德國EPPENDORF。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物乳桿菌的活化 依據文獻[22]中的方法將植物乳桿菌,按3%的接種量,接種于30 mL的MRS液體培養基中,置于37 ℃的恒溫培養箱,靜置培養24 h,同樣方法重復2次活化,使菌種活力達到0.6以上,備用。

1.2.2 菌懸液制備 將活化好的植物乳桿菌按3%的接種量,接種于30 mL的MRS液體培養基中,置于37 ℃恒溫培養箱中培養12 h后,于4000 r/min離心5 min,4 ℃后、收集菌體,再用無菌生理鹽水調節菌懸液的濃度為5.12×109cfu/mL,于4 ℃的冰箱中備用。

1.2.3 微膠囊包埋工藝 取一定量的按照參照文獻[23]配制好的乳清蛋白溶液,于40 ℃ 加熱,置于攪拌器中攪拌,4000 r/min高速分散 10 min至完全溶解,靜置待泡沫消去后加入20 mL在1.2.2中制備的植物乳桿菌菌懸液,于40 ℃ 加熱、攪拌(500 r/min,5 min)攪拌,同時加入一定量的明膠溶液攪拌均勻。置于均質機中均質(25 MPa、50 ℃)設置一定的進料速度與進風溫度,最后噴霧干燥器制備植物乳桿菌微膠囊。

1.2.4 人工腸液配制 稱取磷酸氫二鉀3.4 g,加入250 mL的蒸餾水溶解,再用0.1 mol/L的氫氧化鈉調節pH到6.8,另外,取5 g胰蛋白酶,用適量蒸餾水將其溶解,再將兩溶液混合均勻,最后用蒸餾水定容至500 mL,于4 ℃下儲藏備用。

1.2.5 微膠囊單因素實驗

1.2.5.1 壁材配比對包埋植物乳桿菌包埋率的影響 在壁材添加量為 15%,進風溫度為120 ℃,進料量為25%,壁材質量配比(乳清蛋白:明膠)分別為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5的情況下,考察植物乳桿菌微膠囊包埋率隨壁材配比變化的影響。

1.2.5.2 壁材添加量對包埋植物乳桿菌包埋率的影響 在壁材配比(乳清蛋白與明膠質量比)為1∶1.5,進風溫度為120 ℃,進料量為25%,壁材添加量分別為10%、15%、20%、25%的情況下,考察植物乳桿菌微膠囊包埋率隨壁材用量變化的影響。

1.2.5.3 進風溫度對包埋植物乳桿菌包埋率的影響 在壁材配比(乳清蛋白與明膠質量比)為1∶1.5,壁材添加量為20%,進料量為25%,進風溫度分別為110、120、130、140 ℃的情況下,考察植物乳桿菌微膠囊包埋率隨進風溫度變化的影響。

1.2.5.4 進料量對包埋植物乳桿菌包埋率的影響 在壁材配比(乳清蛋白與明膠質量比)為1∶1.5,壁材添加量20%、進風溫度為120 ℃,進料流量分別為20%、25%、30%、35%的情況下,考察植物乳桿菌微膠囊包埋率隨進料量變化的影響。

1.2.6 響應面優化實驗設計 在單因素的實驗基礎上,對影響植物乳桿菌包埋率的四個因素壁材配比、壁材添加量、進風溫度、進料量設計三水平優化實驗,如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗因素及水平編碼表Table 1 Box-Behnken experimental factors and levels coding table

1.2.7 植物乳桿菌包埋率測定 取噴霧干燥后的微膠囊樣品1 g,置于99 mL人工腸液(pH=6.8),于37 ℃恒溫振蕩器振蕩45 min后,活菌計數[24-25]。

菌體包埋率(%)=1 g樣品中的活菌總數×所得樣品質量/噴霧干燥前加入的植物乳桿菌的活菌總數×100

1.3 數據處理

實驗結果利用Excel和Design-Expert 8.0.6進行實驗數據處理和方差分析。

2 結果和分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 壁材配比(乳清蛋白與明膠質量比)對包埋植物乳桿菌包埋率的影響 從圖1中可以看出,隨著壁材配比(乳清蛋白與明膠質量比)的比值減小,包埋率先增加后降低,當乳清蛋白與明膠的質量比為1∶1.5時,植物乳桿菌微膠囊的包埋率最高,達到60.3%,初步確定壁材配比(乳清蛋白與明膠質量比)為1∶1.5作為響應面優化條件。

圖1 壁材配比(乳清蛋白∶明膠)對包埋率的影響Fig.1 Effect of the ratio of wall material on encapsulation yield注：*表示與本因素水平1的結果相比，包埋率有顯著影響(p<0.05)，圖2～圖4同。

2.1.2 壁材添加量對植物乳桿菌包埋率的影響 從圖2中可以看出,隨著壁材添加量的增加,包埋率先增加后降低,壁材添加量為20%時,植物乳桿菌微膠囊包埋率最高,達到58.7%;當壁材添加量<20%時,由于壁材量不足,使植物乳桿菌暴露在外,在噴霧干燥過程中,會導致包埋效果變差。因此,初步確定壁材添加量為20%作為響應面優化條件。

圖2 壁材添加量對包埋率的影響Fig.2 Effect of wall material on encapsulation yield

2.1.3 進風溫度對包埋植物乳桿菌包埋率的影響 從圖3中可以看出,隨著進風溫度的增加,包埋率先增加后降低,當進風溫度為120 ℃時,植物乳桿菌微膠囊包埋率最高,達到62.7%,超過或低于該溫度,均影響微膠囊包埋率。因此,初步確定進風溫度為120 ℃作為響應面優化條件。

圖3 進風溫度對包埋率的影響Fig.3 Effect of the inlet air temperature on encapsulation yield

2.1.4 進料量對包埋植物乳桿菌包埋率的影響 從圖4中可以看出,隨著進料量的增加,包埋率先增加后降低,進料量為30%時,植物乳桿菌微膠囊包埋率最高,達到52%,當進料量<30%,由于塔內的進風溫度不變,過少的進料量會使植物乳桿菌受到高溫的傷害,導致活性降低,但當進料量超過30%時,過高的進料量會使塔內的含水量增加,影響植物乳桿菌在微膠囊內的穩定性,使其包埋率下降。因此,初步確定進料量為30%作為響應面優化條件。

圖4 進料量對包埋率的影響Fig.4 Effect of the feed rate on encapsulation yield

2.2 響應面實驗設計及結果

通過對表2中的數據進行處理,利用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面分析,得到各因素對植物乳桿菌微膠囊包埋率的二次回歸方程為:

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

Y(%)=58.97-3.01A+4.55B+3.43C+1.41D+1.17AB+1.22AC+0.43AD+0.48BC-2.05BD+1.73CD-4.67A2-3.38B2-3.52C2+0.20D2。

方差分析結果見表3,模型的p小于0.01,說明該二次回歸方程具有高度的顯著性,失擬項p=0.1133>0.05,說明該模型與實驗實際擬合良好,實驗誤差小,較好地反映了植物乳桿菌微膠囊包埋率與壁材配比、壁材添加量、進風溫度和進料量的關系。一次項中A、B、C對包埋率的影響極顯著(p<0.01),二次項中除D2不顯著(p>0.05)外,其余的二次項都顯著,交互項不顯著(p>0.05)。

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Regression model analysis of variance results

2.3 交互效應分析

為了探討交互作用的影響,使其中的兩個因素固定為0水平,得到交互效應方程分別為:

Y(A、B)(%)=558.97-3.01A+4.55B+1.17AB-4.67A2-3.38B2

Y(A、C)(%)=558.97-3.01A+3.43C+1.22AC-4.67A2-3.52C2

Y(A、D)(%)=558.97-3.01A+1.41D+0.43AD-4.67A2+0.20D2

Y(B、C)(%)=558.97+4.55B+3.43C+0.48BC-3.38B2-3.52C2

Y(B、D)(%)=558.97+4.55B+1.41D-2.05BD-3.38B2+0.20D2

Y(C、D)(%)=558.97+3.43C+1.41D+1.73CD-3.52C2+0.20D2

由圖5可以看出，在制備植物乳桿菌微膠囊的過程中,隨壁材配比、壁材添加量、進風溫度、進料量四個因素的增加,對植物乳桿菌微膠囊的包埋率均呈現先增加后減小的趨勢,表明在選定的各變量因素范圍內可以出現最大包埋率。故利用噴霧干燥法制備植物乳桿菌微膠囊,其包埋率存在最大值。

圖5 兩因素交互作用對包埋率的影響響應面圖Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of emulsifier quantity,the core material ratio,casein and the solid concentration on encapsulation yield

2.4 最適工藝參數確定

對實驗結果進行處理,得到噴霧干燥法制備微膠囊的最優組合為:壁材配比為1∶1.93、壁材添加量為22%、進風溫度為127.40 ℃、進料量為35%,包埋率預測值為63.15%。為了能在實際操作過程中更好的控制條件,調整實際條件為:壁材配比為1∶2、壁材添加量為22%、進風溫度為127 ℃、進料量為35%,在此條件下,制得的植物乳桿菌微膠囊的實際包埋率為62.15%,與模型預測值相比,其相對偏差較小。因此,基于響應面法所得的優化噴霧干燥法制備植物乳桿菌微膠囊的工藝參數準確可靠,具有實用價值。

3 結論

經實驗得到噴霧干燥法制備固安縣玉米秸稈中植物乳桿菌微膠囊的最優實際條件為:壁材配比1∶2、壁材添加量22%、進風溫度127 ℃、進料量35%,最終得到的植物乳桿菌微膠囊包埋率為62.15%。乳清蛋白-明膠復合壁材包被植物乳桿菌微膠囊化效果較理想,提高了植物乳桿菌的應用價值,對工業生產有指導作用,為青貯飼料添加劑系列產品研發提供了新思路。

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