基于1H-NMR技術尋找非酒精性脂肪肝肝郁脾虛證的差異代謝標志物?

李若瑜，苗宇船△，蘇趙威，賈 飛，李明磊，劉 楊，郭繼龍，關 偉，張冉冉，何麗清

(1. 山西中醫學院，山西 晉中 030619； 2. 建德市中西醫結合醫院，浙江 建德 311612)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是遺傳-環境-代謝應激相關性疾病。本研究采用核磁共振技術(1H-NMR)分析NAFLD肝郁脾虛證模型大鼠血清中內源性代謝物濃度的變化，以期篩選出與NAFLD肝郁脾虛證相關的代謝標志物，為揭示NAFLD的發病機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠16只，體質量200～220 g，北京海淀興旺實驗動物養殖場提供(實驗動物合格證號SCKK(京)2014-0013)，常規適應性飼養1周后進行實驗。

1.2 主要儀器與試劑

5-羥色胺(5-HT)試劑盒、去甲腎上腺素(NE)試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司；D-木糖排泄率測定試劑盒購自北京奧博星生物技術有限責任公司；600 MHz AVANCE III NMR波譜儀，德國Bruker公司；美國Image-Pro Plus v5.1圖像分析管理系統；D2O，購自美國merck試劑公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 NAFLD肝郁脾虛證動物模型的建立 將實驗大鼠按隨機數字表法分為對照組和模型組各8只，對照組給予基礎飼料喂養，自由飲水；模型組給予高糖高脂飼料+饑飽失常法+慢性束縛應激刺激+夾尾法，建立NAFLD肝郁脾虛證動物模型[1-2]。12周末麻醉采血，常規制備血清，標本儲存于-80 ℃冰箱中備用。取肝左葉石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察肝臟組織學變化。

1.3.2 樣本預處理 取解凍后血清450 μL，加入D2O350 μL渦旋30 s，于4 ℃ 13000 r/min離心20 min，取上清液600 μL，置于內徑5 mm的NMR樣品管中備用。

1.3.3 1H-NMR圖譜處理 采用 Mest Re Nova 核磁圖譜專業處理軟件對所有1H-NMR圖譜進行傅立葉轉換并進行相位、基線調整,以TSP 的化學位移δ 3.04為標準進行化學位移校正。以δ 0.01為單位，對δ 0.01～8.50區域的譜圖進行等寬度分割,去除δ 4.67～4.90區域水峰；對圖譜進行分段積分,將積分數據歸一化處理,使數據集中在 0～1 內用于多元統計分析。

1.4 統計學方法

2 結果與分析

2.1 NAFLD肝郁脾虛證模型復制驗證結果

2.1.1 一般行為學特點 模型組大鼠表現為明顯厭食，體質量減輕，行動遲緩，弓背靜臥，背毛散亂無光澤，糞便溏軟。

2.1.2 NAFLD病理組織學結果 圖1、2顯示，對照組大鼠可見正常肝組織形態；模型組大鼠肝細胞胞質內有大小不等的脂肪空泡,將細胞核擠壓至一側(黑色箭頭所示),肝小葉、門管區炎細胞浸潤，表明大鼠非酒精性脂肪肝模型復制成功。

表1 各組大鼠GLU、FFA、5-HT、NE、D-木糖排泄率變化比較

注： 與對照組比較：*P<0.05

圖1 對照組大鼠肝組織病理切片(HE染色 ×400)

圖2 模型組大鼠肝組織病理切片(HE染色 ×400)

2.1.3 肝郁脾虛證指標檢測結果 表1顯示，與對照組比較模型組血糖、血脂升高，5-HT、NE和D-木糖排泄率顯著降低(P<0.05)，成功建立大鼠肝郁脾虛證模型。

圖3 大鼠血清1H-NMR圖譜注：1.丙酮[2.24(s)]；2.精氨酸[1.72(m)3,25(t)]；3.丙氨酸[1.48(d)3.77(q)]；4.甜菜堿[3.28(s)]；5.肌酐[3.04(s)3.94(s)]；6.α-D-葡萄糖[5.24(d)3.23(t)]；7.β-D-葡萄糖[4.65(d)]；8.二甲基甘氨酸[2.92(s)3.70(s)]；9.3-羥基丁酸[1.20(d)]；10.甘油[3.54(dd)3.66(dd)]；11.糖原[5.39(s)]；12.異亮氨酸[0.99(d)3.65(d)]；13.α-酮戊二酸[2.44(t)]；14.乳酸[1.33(d)、4.12(q)]；15.亮氨酸[0.96(t)]；16.賴氨酸[1.72(m)1.90(m)]；17.肌醇[3.53(d)]；18.N-乙酰糖蛋白[2.05(s)]；19.O-乙酰糖蛋白[2.14(s)]；20.琥珀酸[2.37(s)]；21.蘇氨酸[1.33(d)3.58(d)4.24(q)]；22.酪氨酸[6.89(d)]；23.纈氨酸[1.01(d)3.61(d)]

2.2 代謝組學結果

2.2.1 圖3顯示，1H-NMR圖譜的指認與分析 通過大鼠血清1H-NMR圖譜，結合HMDB數據庫指認出23種代謝產物，各物質對應化學位移與峰型。

2.2.2 多元統計分析 圖4、5顯示，運用SIMCA-P+ 進行PLS-DA分析得出積分圖和S-plot圖。圖4顯示，模型組與對照組明顯沿t[1]軸分開，提示組間差異明顯，模型R2X=0.436，R2Y=0.999，Q2=0.875，即其中43.6%的變量作為主要成分構造模型，模型的解釋率99.9%，模型的預測率87.5%。圖5中“S”曲線上的點離原點越遠，其VIP值越大，代謝產物差異越明顯。由圖中可以找到VIP>1差異顯著的代謝產物。

2.2.3 尋找差異代謝產物 表2顯示，運用SPSS17.0軟件對所有代謝物的相對峰面積進行獨立樣本t檢驗，差異有統計學意義(P<0.05)者結合S-Plot圖的VIP值進行多元統計，得出9種可能是中醫證候潛在生物標志物的差異代謝物，并對其相對峰面積的變化進行計算。

圖4 大鼠血清1H-NMR下PLS-DA積分圖注：PC=3，R2X=0.436，R2Y=0.999，Q2=0.875

圖5 大鼠血清1H-NMR下S-plot圖注：PC=3，R2X=0.436，R2Y=0.999，Q2=0.875

代謝物化學位移(ppm)變化趨勢峰面積對照組模型組丙酮2.24+1.98×10-1±6.50×10-24.12×10-1±1.15×10-1**丙氨酸1.48-7.00×10-1±8.80×10-24.51×10-1±1.22×10-1**甜菜堿3.28+5.30×10-1±1.50×10-11.01×10-0±4.00×10-1*α-D-葡萄糖5.24+6.63×10-1±1.58×10-19.13×10-1±1.07×10-1**甘油3.66+2.12×10-1±2.20×10-23.25×10-1±7.10×10-2**異亮氨酸3.65+1.86×10-1±1.90×10-22.54×10-1±3.70×10-2**α-酮戊二酸2.44+2.15×10-1±4.10×10-23.33×10-1±8.60×10-2**蘇氨酸3.58+1.02×10-1±2.00×10-21.41×10-1±2.10×10-2**賴氨酸1.72+1.41×10-1±3.80×10-21.83×10-1±4.30×10-2*

注： 與對照組比較:*P<0.05,**P<0.01

3 討論

NAFLD是代謝綜合征在肝臟的表現，其基本病理過程是以脂質攝取過多和胰島素抵抗為首要環節引起脂肪在肝臟細胞儲積，涉及能量代謝紊亂和脂質過氧化、免疫應答紊亂等復雜過程。中醫認為，肝與脾在生理病理上聯系密切，肝主疏泄，脾主升清、運化，疏泄與運化相互為用。肝郁脾虛證的主要病機即肝失疏泄、脾失健運，正對應NAFLD過程中的物質能量代謝紊亂。NAFLD導致肝細胞受損后，肝臟代謝組分的變化可通過檢測血液獲得[3]，因此對NAFLD肝郁脾虛證的血清代謝組學研究具有重要意義。

模型組血清中甘油與FFA水平升高，可能提示機體內脂肪酸水平升高，而過量的脂肪酸在氧化過程中產生大量ROS，導致肝細胞脂肪變性和壞死。甜菜堿可分解為三甲胺，是脂質代謝的中間產物，其在甘氨酸合成時提供甲基，減輕脂質過氧化作用，增加脂類代謝。模型組中甜菜堿的增多提示脂質代謝增多。

胰島素抵抗貫穿NAFLD整個過程，最直觀的判定特征就是葡萄糖的攝取利用，模型組大鼠血糖明顯升高，提示組織對葡萄糖的利用率降低。丙酮是脂肪酸分解時產生的酮類化合物，其含量升高提示能量代謝的過程從葡萄糖利用轉為脂肪酸氧化。血清α中-酮戊二酸增加，表明三羧酸循環封閉[4]。

肝臟作為氨基酸代謝的中心，任何肝損傷都可能干擾氨基酸的代謝[5]。肝細胞膜損傷使細胞內蛋白質合成受到抑制，對氨基酸清除率降低，對胰高血糖素的滅活降低，導致內源性蛋白處于高分解狀態，釋放出大量的氨基酸，使血中氨基酸水平增高[6]。模型組大鼠異亮氨酸水平升高，提示機體啟動了支鏈氨基酸的糖異生作用，以補充機體所需的能量[7]。蘇氨酸可與寡糖鏈結合，對保護肝細胞膜起重要作用，亦能促進磷脂合成和脂肪酸氧化，其水平升高可能是機體對NAFLD產生應激反應的結果，丙氨酸水平下降則與糖尿病等胰島素抵抗引起的疾病有關。

有研究表明[8]，糖類、脂類、蛋白質的代謝紊亂可能是中醫證候的物質基礎。本實驗測定了血清中9種與NAFLD相關的內源性代謝物含量的變化并進行綜合分析，從脂質代謝紊亂、胰島素抵抗及氨基酸代謝紊亂等不同方面反映出NAFLD肝郁脾虛證的部分發病機制，有利于確定NAFLD肝郁脾虛證特征性的代謝變化，為證候客觀化研究提供了新的方法與思路。

參考文獻：

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