愈癲湯對MK-801致精神分裂癥模型大鼠Glu-DA神經遞質系統的影響?

趙玉萍，柴劍波，高 瀟，于 明，趙永厚△

(1. 黑龍江神志醫院,哈爾濱 150036； 2. 黑龍江神志醫院博士后科研工作站,哈爾濱 150036；復旦大學博士后中西醫結合流動站,上海 200433)

谷氨酸-多巴胺(Glu-DA)神經遞質系統紊亂是精神分裂癥發病的重要機制[1]。中醫神志病學認為，精神分裂癥病位在腦，核心病機為痰瘀互結、腦神失調，據此化裁愈癲湯乃黑龍江神志醫院院內制劑經驗方，臨證取得確切療效。本研究以谷氨酸(Glu)-多巴胺(DA)神經遞質系統為切入點，觀察“消痰化瘀”之愈癲湯對精神分裂癥模型大鼠腦組織NO活性、MDA含量及nNOSmRNA、DA、Glu表達情況的影響，為闡明其干預精神分裂癥的作用機制奠定研究基礎。

1 材料

1.1 動物

48只雄性成年SD大鼠(300±20 g)，購自黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心(合格證號SCXK(黑)2013-004)。

1.2 藥物

愈癲湯組成：制半夏15 g，制天南星15 g，牽牛子10 g，三棱15 g，莪術15 g，檳榔15 g，大黃10 g，茵陳蒿15 g。將1劑上述飲片放入煎藥器皿中加12倍量清水浸泡2 h，武火煎煮10 min，文火再煎煮30 min后過濾煎液，之后再加8倍量水武火煎煮10 min，文火再煎煮30 min過濾煎液,濾除藥渣后將2次煎煮藥液合并加熱濃縮至111 ml后，藥液濃度為0.92 g/ml。

利培酮片：江蘇恩華藥業股份有限公司(生產批號20120501)，購自黑龍江神志醫院藥局。將4 mg利培酮片研成粉末，加111 ml蒸餾水后恒溫水浴震蕩20 min，配制成0.036 mg/ml的利培酮懸濁液。地卓西平(MK-801)注射液：取MK-801(美國SIGMA公司生產)1 mg溶于1 ml氯化鈉溶液中，配制成濃度為1 mg/ml儲備藥液，造模時將儲備藥液稀釋為0.1 mg/ml注射液。

1.3 主要試劑及儀器

主要試劑：神經型一氧化氮試劑盒(南京建成A012)；MDA測定試劑盒(南京建成A003-1)；高純總RNA快速提取試劑盒(中國BioTeke RP1201)。主要儀器：ELX-800型酶標儀(美國BIOTEK公司)；UV752型紫外可見光分光光度計(湖南湘儀)；Life Express-PCR儀(杭州BIOER)；凝膠成像分析儀(北京六一WD-9413B)及LC-6 A高效液相色譜儀(日本島津)。

2 方法

2.1 分組

實驗大鼠自由攝食水，適應性飼養1周，應用計算機軟件為每只動物自然序號賦予1個3位隨機數，按隨機數大小分入空白組、模型組、利培酮組及愈癲湯組，每組各12只。

2.2 造模方法

除空白組外，各組大鼠按照0.1 mg/kg體質量劑量腹腔注射0.1 mg/mLMK-801注射液，注射位置選擇大鼠左或右(每日交替)下側腹腔略靠近外側1/3處；空白組大鼠應用0.9%氯化鈉溶液行相同方法腹腔注射，連續14 d[1-3]。

2.3 給藥方法

于實驗開始第15天進行干預性給藥，空白組、模型組給予蒸餾水灌胃(1 ml/100 g)，對照組及治療組大鼠于模型制備成功后分別給予利培酮懸濁液灌胃(0.5 ml/100 g)，愈癲湯水煎劑灌胃(1 ml/100 g)，持續灌胃14 d。

2.4 觀察指標及檢測方法

2.4.1 應用分光光度計測定額前腦組織NO活性、MDA含量 加入9倍體積PBS，將額前腦組織打碎后用液氮反復凍融3次，應用12000 r/min離心10 min，取上清液低溫冷凍待用。通過蛋白質定量測定制備標準曲線，參照試劑盒說明書操作并計算NO活性和MDA含量。

2.4.2 應用PCR法測定額前腦組織nNOSmRNA的表達 應用RNA試劑盒提取樣本總RNA，將得到的RNA樣本進行反轉錄，對上步實驗所得的RNA樣本進行反轉錄以得到對應的cDNA，建立PCR反應體系，將引物按照設計的PCR反應程序操作，之后經電泳過后利用凝膠成像系統對得到的凝膠進行拍照，并應用凝膠圖像處理系統分析光密度值得出結果。

2.4.3 HPLC-ECD法測定額前腦組織Glu、DA表達情況 選用HPLC-ECD將冷凍的額前腦組織加1 mL預冷的95%乙醇，12000 r/min離心3 min，然后取5 μL樣品于離心管中，加入50 μL衍生工作液渦旋震蕩1 min，取樣20 μL注入色譜儀，記錄色譜圖計算峰面積，得出Glu、DA表達情況。

2.5.統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠額前葉組織NO活性、MDA含量、nNOSmRNA表達比較

表1顯示，與空白組比較，模型組NO活性、MDA含量及nNOSmRNA表達皆明顯升高(P<0.01，P<0.05)；而治療組能顯著降低NO活性、MDA含量及nNOSmRNA表達(P<0.05)，且在降低MDA方面明顯優于對照組(P<0.05)。

表1 各組大鼠額前腦組織NO活性、MDA含量、nNOSmRNA表達比較

注：與空白組比較:*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較:▲P<0.05；與對照組比較:■P<0.05

3.2.各組大鼠額前葉組織Glu、DA表達比較

表2顯示，與空白組比較模型組Glu表達程度明顯降低，DA表達明顯升高(P<0.05)；而治療組能顯著升高Glu的表達，降低DA的表達，且明顯優于對照組(P<0.05)。

表2 各組大鼠額前腦組織Glu、DA表達情況比較

注：與空白組比較:*P<0.05；與模型組比較:▲P<0.05；與對照組比較:■P<0.05

4 討論

現代醫學認為，精神分裂癥的發病與Glu神經元功能障礙及DA功能亢進密切相關，且精神分裂癥發病極易體現出二者同時出現所相關聯的Glu-DA神經遞質系統紊亂。一般認為，腦組織中Glu和DA是一對具有相互調節作用的神經遞質，精神分裂癥患者腦組織內特別是額前組織中存在Glu能神經元功能不足，并由此導致基底神經節過度釋放DA，經由紋狀體-丘腦-皮質通路刺激皮質Glu能神經元，結果形成正反饋而最終導致Glu的過度釋放形成神經毒性。Glu神經毒性可導致NO信號通路及氧化應激反應的激活，基于NO信號通路角度，Glu神經毒性可以使NMDA受體激活增多，致細胞內游離Ca+濃度增加，使nNOS從質膜轉移到細胞質進而生成NO，NO進而反作用于Glu進一步導致Glu的過度釋放加重神經毒性。鑒于Glu與DA的互相調節作用，其可以使DA病理性的加速釋放[4-9]。而基于氧化應激反應角度，Glu神經毒性可以導致MDA含量升高，致DA神經元出現神經毒性反應甚則凋亡[10]。故精神分裂癥可見Glu神經元功能障礙及DA功能亢進同時出現，具體表現為Glu-DA神經遞質系統紊亂。

中醫神志病學認為，精神分裂癥屬于中醫“癲狂病”范疇，其所具有的潛伏期長、癥狀隱匿等特殊的發病特點，使得臨證中痰瘀互結型患者尤為多見，在病理特點上體現出典型的痰凝血瘀證候特征。因此，本病的治療亦應從痰瘀入手，以消痰化瘀、破結行氣為綱。據此，擬愈癲湯方以3組藥物分領滌痰、祛瘀、行氣三岐。半夏、南星燥濕化痰，消痞散結；牽牛子性寒味苦，消飲滌痰，三者相伍則祛痰之功卓著。三棱、莪術破血逐瘀而行氣，檳榔行氣消積，三者相伍使瘀行氣暢。同時牽牛子得檳榔之助，則氣順而痰自消，行氣之功增強；檳榔得牽牛子之輔，破氣之功更著。瘀久必化熱，茵陳蒿利濕清熱，亦可得大黃利濕之助。且方中大黃既可攻積瀉下，給痰瘀之邪以出路，又兼化瘀之力。綜觀全方,痰瘀同治、氣血兼調則必使痰濁漸去而瘀血漸消,腦竅再現清靈通利之功。

研究發現，消痰活血之愈癲湯可顯著抑制精神分裂癥模型大鼠額前腦組織內MDA含量、NO活性及nNOSmRNA的表達，表現出對MK-801所致精神分裂癥模型大鼠額前腦組織內Glu及DA表達的正性調節作用，發揮了顯著穩定Glu-DA神經遞質系統的作用，提示愈癲湯可能通過阻斷NO信號通路及氧化應激反應消除Glu神經毒性，維持Glu-DA神經遞質系統的穩定。

參考文獻：

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