單寧酸通過抑制TRAF6向細(xì)胞質(zhì)膜的招募抑制Akt信號(hào)通路

阮海華，胡雙艷，張春晨，曹 婳，張 真

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱Akt）信號(hào)通路是生物體內(nèi)一條非常重要的生存信號(hào)通路[1-2]。EGFR主要是通過二聚化后刺激Ras蛋白，導(dǎo)致磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活A(yù)kt信號(hào)通路，故有學(xué)者將其稱為EGFR/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路[3]。EGFR/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路在實(shí)體腫瘤，如黑色素瘤、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌和白血病中發(fā)揮重要的作用，促進(jìn)細(xì)胞侵襲遷移、加速細(xì)胞周期進(jìn)程、促進(jìn)細(xì)胞增殖[4]。明確該信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制，尋找阻斷該信號(hào)通路的靶向藥物是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一。

植物多酚是來源于植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，大量的研究表明植物多酚具有抗突變[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、抗菌[8]等生物學(xué)活性。單寧酸屬于易溶于水的植物多酚類化合物，在紅葡萄酒、茶葉、水果中均含量較多[9]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，單寧酸能夠作用于乳腺癌細(xì)胞EGFR，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[10]。在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，通過檢測EGFR全酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化發(fā)現(xiàn)，單寧酸處理顯著抑制了由表皮生長因子誘導(dǎo)的EGFR的磷酸化，而且具有位點(diǎn)特異性。例如，單寧酸能夠抑制EGFR Y1068和Y1045的磷酸化，進(jìn)而抑制受這些特異位點(diǎn)磷酸化調(diào)控的信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號(hào)通路，阻斷受STAT3信號(hào)通路調(diào)控的基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。實(shí)際中眾多研究表明，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是多因素、多基因、多途徑的結(jié)果。除了STAT3信號(hào)通路，在大部分人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞以及頭頸癌細(xì)胞中，EGFR/Akt信號(hào)通路均存在不同程度的失調(diào)。然而，單寧酸對(duì)EGFR/Akt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)單寧酸抑制EGFR的磷酸化，改變腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis receptor-associated factor 6，TRAF6）蛋白的亞細(xì)胞定位，而TRAF6亞細(xì)胞定位的改變介導(dǎo)了單寧酸對(duì)Akt信號(hào)通路的調(diào)控，抑制人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞由東京大學(xué)醫(yī)學(xué)院Jun-Ichiro Inoue教授提供。

單寧酸（CAS號(hào)1401-55-4，相對(duì)分子質(zhì)量為1 701.20） 美國Sigma-Aldrich公司；Gibco胎牛血清、Protein A/G免疫沉淀磁珠 美國Thermo Fisher Scientific公司；HyClone? DMEM高糖培養(yǎng)基 美國GE Healthcare公司；磷酸化EGFR（Tyr1068）抗體、EGFR抗體、磷酸化Akt（S473）抗體、Akt抗體（鼠源）、TRAF6抗體（鼠源）、磷酸化真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（eukaryotic translation initiation fator 4E-binding protein 1，4EBP-1）抗體、磷酸化S6抗體 美國Cell Signaling Technology公司；微管蛋白、小窩蛋白1、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯(lián)二抗 美國Santa Cruz Technology公司；TRAF6抗體（兔源）、Akt（兔源） 美國Millipore公司；電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒、VigoFect轉(zhuǎn)染試劑 威格拉斯生物技術(shù)（北京）有限公司；3-（4,5-二甲基吡啶-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium，MTS）細(xì)胞增殖試劑盒（G3850） 美國Promega公司。

pcDNA3質(zhì)粒由西南大學(xué)李洪濤博士惠贈(zèng)；編碼EGFR vIII突變體的基因序列為從EGFR cDNA序列（GenBank：BC094761.1）中去除編碼第2～7位外顯子間，即去除第241～870位核苷酸的序列。進(jìn)行全基因合成后，克隆至pcDNA3質(zhì)粒中。

其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)皿 美國Corning公司；HERACELL 150i CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher公司；SpectraMax M5多功能讀板機(jī) 美國Molecular Device公司；Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印槽、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；Alpha Imager Mini凝膠成像系統(tǒng) 美國Protein Simple公司；5430R小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）中，并置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化傳代。當(dāng)單層細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行單寧酸處理。處理培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基內(nèi)含80 μmol/L單寧酸，每組3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72 h后，用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，并收集至離心管中。

1.3.2 MTS法檢測單寧酸對(duì)U87細(xì)胞增殖的影響

U87細(xì)胞以6×104個(gè)/mL的濃度接種于96 孔板內(nèi)，每孔100 μL培養(yǎng)基。24 h后棄培養(yǎng)基，分別加入100 μL含80 μmol/L單寧酸的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24、48、72 h，每組3 個(gè)復(fù)孔。采用MTS細(xì)胞增殖試劑盒測定OD490nm值。

1.3.3 蛋白質(zhì)印記法檢測U87細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)和磷酸化

均采用蛋白質(zhì)印記法。細(xì)胞處理方法同1.3.1節(jié)，收集細(xì)胞，參照文獻(xiàn)[11]制備蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂乳粉封閉。將一抗按照體積比1∶1 000稀釋后于4 ℃孵育過夜。以TBST（tris buffered saline with Tween）溶液洗滌3 次后加入體積比1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影曝光后洗X光片，利用Alpha Imager Mini凝膠成像系統(tǒng)測定條帶的灰度值，利用灰度值表征條帶的強(qiáng)度。

1.3.4 免疫共沉淀

收集單寧酸處理后細(xì)胞，利用裂解緩沖液（50 mmol/L Tris溶液（pH 7.6）、1 mol/L NaCl、1% NP-40、0.5% Triton X-100、5%脫氧膽酸鈉、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、蛋白酶抑制劑Cocktail）按照干細(xì)胞與裂解液1∶3的比例加入裂解液。冰浴30 min，用勻漿器反復(fù)勻漿100 次。于15 000×g低溫離心30 min，收集上清液，在上清液中加入Protein A/G免疫沉淀磁珠于4 ℃混懸30 min。將混懸液置于磁力收集器上，棄沉淀，收集上清液。將上清液中加入兔源抗TRAF6抗體于4 ℃混懸過夜，次日在混懸液中加入Protein A/G免疫沉淀磁珠于室溫混懸1 h，收集Protein A/G 免疫沉淀磁珠沉淀，并用10 倍體積裂解液反復(fù)潤洗沉淀3 次，用SDS-PAGE 1×上樣緩沖液溶解沉淀Protein A/G免疫沉淀磁珠后，進(jìn)行抗鼠源TRAF6以及抗鼠源Akt的蛋白質(zhì)印跡檢測。以全細(xì)胞裂解液（whole cell lysate，WCE）作為上樣參照，微管蛋白作為內(nèi)參。

1.3.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞培養(yǎng)至2×106個(gè)/10 cm2細(xì)胞培養(yǎng)板的密度后，按照Vigofect轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行單寧酸處理后收集細(xì)胞，進(jìn)行免疫共沉淀以及蛋白質(zhì)印跡分析。

1.3.6 細(xì)胞亞組分分離

單寧酸處理人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞后，細(xì)胞亞組分分離參照文獻(xiàn)[12]的方法。利用超速離心機(jī)于80 000×g低溫離心2 h后，上清液部分即為細(xì)胞胞漿組分；將收集的沉淀繼續(xù)用10 倍體積緩沖液重懸后，再次利用超速離心機(jī)進(jìn)行上述操作，獲得的沉淀部分即為質(zhì)膜部分。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS V18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，同時(shí)通過Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P＜0.05為差異顯著。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少重復(fù)3 次，用 ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單寧酸處理抑制人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖

通過MTS細(xì)胞增殖檢測試劑盒研究單寧酸對(duì)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 單寧酸處理對(duì)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖活性的影響Fig. 1 Effect of tannic acid on the proliferation of human glioma U87 cells

由圖1可知，與對(duì)照組細(xì)胞相比，80 μmol/L單寧酸處理24 h顯著抑制人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖（P＜0.05），并且細(xì)胞增殖抑制率隨著單寧酸處理時(shí)間的延長（48～72 h）而升高。80 μmol/L單寧酸處理48、72 h后，發(fā)生細(xì)胞死亡的比率分別達(dá)到27.9%和45.8%，這與Darvin等[10]發(fā)現(xiàn)單寧酸能夠抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的結(jié)果相類似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單寧酸能夠顯著抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，抗腫瘤效果顯著。

2.2 單寧酸抑制人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞Akt信號(hào)通路的磷酸化

為了進(jìn)一步研究單寧酸對(duì)EGFR/Akt信號(hào)通路的影響，用80 μmol/L單寧酸處理人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，并檢測Akt的磷酸化情況。由圖2可知，80 μmol/L單寧酸處理對(duì)Akt蛋白的整體表達(dá)未見明顯影響，但顯著抑制了Akt絲氨酸473位點(diǎn)的磷酸化（pS473）。一般來講，磷酸化激活的Akt可磷酸化激活其下游2 個(gè)效應(yīng)蛋白靶點(diǎn)：4EBP-1[13]和核糖體S6蛋白[14]的磷酸化。其中，4EBP-1蛋白在不同信號(hào)因子的刺激下（例如紫外照射、生長因子、胰島素等）被磷酸化激活而從4EBP上分離下來，結(jié)合并促進(jìn)帽結(jié)構(gòu)依賴性（cap-dependent）mRNA翻譯蛋白的起始[15]；核糖體S6蛋白被磷酸化后，促進(jìn)5’ TOP（5’terminal oligopyrimidine tract）mRNA翻譯蛋白的起始，進(jìn)而促進(jìn)翻譯起始和許多翻譯元件成分如核糖體蛋白、延伸因子等的翻譯，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[16]。通過檢測單寧酸對(duì)4EBP-1以及核糖體S6蛋白磷酸化的影響發(fā)現(xiàn)，與單寧酸抑制Akt pS473的結(jié)果相一致，單寧酸顯著抑制了4EBP-1絲氨酸65（Ser65）位點(diǎn)的磷酸化以及核糖體S6蛋白絲氨酸235和236（Ser235/236）位點(diǎn)的磷酸化。利用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)Akt pS473的條帶進(jìn)行灰度掃描，結(jié)果如圖3所示。

圖2 單寧酸處理對(duì)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞Akt及其下游效應(yīng)蛋白磷酸化的影響Fig. 2 Effect of tannic acid on the phosphorylation of Akt and its downstream effector proteins in human glioma U87 cells

圖3 Western blot灰度掃描定量分析單寧酸對(duì)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞Akt及其下游效應(yīng)蛋白磷酸化水平的影響Fig. 3 Quantitative analysis of tannic acid on phosphorylated Akt and its downstream effector proteins in human glioma U87 cells by Western blot

由圖3可知，以對(duì)照組設(shè)定值為100%，發(fā)現(xiàn)80 μmol/L單寧酸處理24 h后，對(duì)Akt pS473的抑制率達(dá)到25.3%；而處理48 h后，抑制率接近50%。通過蛋白條帶灰度掃描計(jì)算抑制率發(fā)現(xiàn)，當(dāng)處理72 h時(shí)，單寧酸對(duì)4EBP-1蛋白pSer65的抑制率達(dá)到88.4%，對(duì)核糖體S6蛋白pSer235/236的抑制率達(dá)到74.7%。綜上所述，表明單寧酸處理抑制Akt信號(hào)分子的磷酸化，并抑制了受Akt信號(hào)通路調(diào)控的4EBP-1和核糖體S6蛋白的磷酸化，抑制蛋白質(zhì)的翻譯合成，誘導(dǎo)人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞凋亡。

2.3 單寧酸處理抑制TRAF6與Akt蛋白間的相互作用

圖4 單寧酸對(duì)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞Akt與TRAF6間相互作用的影響Fig. 4 Effect of tannic acid on interaction between Akt and TRAF6 in human glioma U87 cells

TRAF6是細(xì)胞中介導(dǎo)EGFR/Akt信號(hào)通路的重要中間分子，EGFR的過度激活能夠招募TRAF6至細(xì)胞膜，TRAF6與Akt結(jié)合并通過其自身的RING型泛素連接酶活性催化Akt的泛素化修飾，進(jìn)而介導(dǎo)泛素依賴的Akt磷酸化激活[17]?；诖?，本研究利用TRAF6抗體免疫沉淀TRAF6蛋白，分析單寧酸對(duì)TRAF6和Akt間相互作用的影響。由圖4可知，在沉淀的TRAF6蛋白中成功檢測到Akt蛋白，然而與對(duì)照組相比，經(jīng)單寧酸處理的細(xì)胞中與TRAF6共沉淀的Akt蛋白的數(shù)量明顯減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)單寧酸處理后，細(xì)胞中與TRAF6結(jié)合的Akt蛋白明顯減少，進(jìn)而導(dǎo)致依賴TRAF6的Akt磷酸化受到抑制。綜上所述，表明單寧酸對(duì)Akt信號(hào)通路的抑制作用是通過TRAF6的介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。

2.4 單寧酸抑制TRAF6向細(xì)胞質(zhì)膜的招募

由于TRAF6介導(dǎo)的Akt磷酸化主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)膜[17]，為了研究TRAF6的作用機(jī)制，本研究檢測了單寧酸對(duì)TRAF6亞細(xì)胞定位的影響。由圖5、6可知，單寧酸對(duì)人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞胞漿中TRAF6蛋白量影響不大，卻顯著減少了細(xì)胞質(zhì)膜上的TRAF6蛋白的數(shù)量。通過蛋白條帶灰度掃描發(fā)現(xiàn)，單寧酸處理24、48、72 h后，質(zhì)膜上TRAF6蛋白分別減少了43.7%、50.0%和76.7%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單寧酸處理抑制TRAF6蛋白向細(xì)胞質(zhì)膜的招募。結(jié)合圖4中單寧酸減少了與TRAF6互作的Akt蛋白的數(shù)量，可推測單寧酸通過降低TRAF6向細(xì)胞質(zhì)膜的招募導(dǎo)致與TRAF6結(jié)合的Akt蛋白減少，進(jìn)而抑制Akt的磷酸化。

圖5 單寧酸對(duì)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞TRAF6亞細(xì)胞定位的影響Fig. 5 Effect of tannic acid on the subcellular localization of TRAF6 in human glioma U87 cells

圖6 Western blot灰度掃描定量分析單寧酸對(duì)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞TRAF6亞細(xì)胞定位的影響Fig. 6 Quantitative analysis of tannic acid on TRAF6 subcellular localization in human glioma U87 cells by Western blot

2.5 單寧酸抑制TRAF6向細(xì)胞質(zhì)膜的招募與EGFR的磷酸化的相關(guān)性

EGFR是一種糖蛋白，主要由3 個(gè)部分組成：第一部分是胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括N端621 個(gè)氨基酸殘基，這些殘基富含半胱氨酸，并形成多對(duì)二硫鍵，其上結(jié)合有糖基，是表皮生長因子結(jié)合的位點(diǎn)；第二部分是跨膜結(jié)構(gòu)域，由23 個(gè)氨基酸殘基組成；第三部分是胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域，由542 個(gè)氨基酸殘基組成，含有酪氨酸激酶和幾個(gè)酪氨酸磷酸化的位點(diǎn)[18]。為了研究單寧酸調(diào)控TRAF6質(zhì)膜招募是否與EGFR的磷酸化有關(guān)，在人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中表達(dá)EGFR組成型激活突變體EGFR vIII。EGFR vIII突變體中編碼EGFR胞外區(qū)的第2～7位間外顯子丟失，導(dǎo)致EGFR蛋白胞外配體響應(yīng)區(qū)缺失，形成分子質(zhì)量為155 kDa左右的突變蛋白[19]。與野生型EGFR的激活受胞外配體，例如表皮生長因子（epidernal growth factor，EGF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）等的激活不同，EGFR vIII能夠在沒有配體存在的條件下組成型激活[20]。因此，在人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中利用pcDNA3質(zhì)粒載體異位表達(dá)EGFR vIII突變體，轉(zhuǎn)染24 h后檢測EGFRvⅢ突變體的磷酸化，結(jié)果如圖7所示。

圖7 單寧酸對(duì)過表達(dá)EGFRvⅢ突變體細(xì)胞中TRAF6細(xì)胞質(zhì)膜招募的影響Fig. 7 Effect of tannic acid on TRAF6 recruitment to plasma membrane after ectopic expression of EGFRv III mutant in human glioma U87 cells

由圖7可知，利用EGFR抗體成功檢測到EGFR vⅢ突變體蛋白的表達(dá)，其分子質(zhì)量略小于野生型EGFR蛋白的分子質(zhì)量。進(jìn)一步檢測EGFR的磷酸化（Y1068）發(fā)現(xiàn)在沒有任何配體（EGF）存在的條件下，檢測到EGFR vⅢ突變體的組成型激活。但是，與對(duì)照組相比，單寧酸處理48 h后雖然對(duì)野生型EGFR的磷酸化有抑制作用，但是對(duì)EGFR vIII突變體的磷酸化未表現(xiàn)抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單寧酸對(duì)EGFR磷酸化的抑制作用需要EGFR胞外區(qū)第2～7位外顯子間的區(qū)域，該區(qū)域的丟失導(dǎo)致EGFR的磷酸化對(duì)單寧酸不敏感，該區(qū)域是單寧酸調(diào)控EGFR的關(guān)鍵區(qū)。同時(shí)，在EGFR vIII突變體過表達(dá)的細(xì)胞中，Akt和TRAF6招募至細(xì)胞質(zhì)膜上的數(shù)量未受到單寧酸的影響，即EGFR vIII磷酸化激活不受單寧酸影響后，招募至細(xì)胞質(zhì)膜上TRAF6和Akt的數(shù)量也不受單寧酸影響，表明單寧酸通過調(diào)控EGFR磷酸化抑制TRAF6向細(xì)胞質(zhì)膜的招募，而質(zhì)膜TRAF6的減少介導(dǎo)了Akt磷酸化信號(hào)的抑制，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。綜上所述，EGFR可能是單寧酸的受體，單寧酸通過EGFR實(shí)現(xiàn)跨膜信號(hào)傳遞，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，發(fā)揮抗腫瘤功效。

3 討 論

TRAF6是腫瘤壞死因子超家族（tumor necrosis factor，TNF）和Toll樣/白細(xì)胞介素-1受體（Toll/IL-1 receptor，TIR）超家族重要的接頭分子[21]，在天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮多重的作用[22]。同時(shí)TRAF6是細(xì)胞中介導(dǎo)EGFR/Akt信號(hào)通路的重要中間分子[17]。TRAF6具有泛素連接酶活性[23]，其可泛素化修飾Akt進(jìn)而介導(dǎo)泛素途徑依賴的Akt磷酸化激活[24]。TRAF6通常作為一個(gè)開關(guān)，決定在細(xì)胞內(nèi)開啟何種信號(hào)[17]。本研究結(jié)果表明，細(xì)胞經(jīng)單寧酸處理后，招募至質(zhì)膜上的TRAF6蛋白減少，進(jìn)而介導(dǎo)了單寧酸對(duì)EGFR/Akt信號(hào)通路的抑制作用，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。其中，質(zhì)膜招募TRAF6蛋白的減少可以通過兩個(gè)方面抑制Akt的磷酸化激活：一方面與TRAF6直接相互作用的Akt蛋白數(shù)量減少，該推論已經(jīng)被圖4的結(jié)果證實(shí)，導(dǎo)致Akt磷酸化被抑制；另一方面，TRAF6是激活轉(zhuǎn)化生長因子激酶1（transform growth factor kinase，TAK1）的關(guān)鍵蛋白[25]，例如，轉(zhuǎn)化生長因子（transform growth factor，TGF）通過TRAF6激活TAK1[26]，而TAK1是磷酸化Akt的蛋白激酶[27]。因此，單寧酸抑制質(zhì)膜TRAF6的招募，進(jìn)而抑制TAK1的激活，導(dǎo)致Akt磷酸化抑制的可能性也不能排除。

單寧酸對(duì)EGFR磷酸化的調(diào)節(jié)作用依賴于EGFR胞外區(qū)第2～7位外顯子所在片段，即從第81～290位氨基酸殘基間的片段，該片段恰好為EGF結(jié)合區(qū)[19]，推測單寧酸可能通過和EGF競爭與EGFR結(jié)合，發(fā)揮其抗腫瘤作用。另外，單寧酸與EGFR結(jié)合后，可能誘導(dǎo)EGFR或其二聚體發(fā)生特定的構(gòu)象變化，使部分位點(diǎn)的磷酸化受到空間限制，不易于發(fā)生磷酸化激活，但對(duì)有的位點(diǎn)影響不大，其原因還需要進(jìn)一步深入研究。因?yàn)閱螌幩釋儆谥参锒喾宇愇镔|(zhì)[28]，分子質(zhì)量偏大，易溶于水，其化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致單寧酸很難穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，因此，單寧酸通過作用于EGFR胞外區(qū)，抑制腫瘤細(xì)胞中異常激活的EGFR磷酸化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)單寧酸信號(hào)的跨膜傳遞。已有研究發(fā)現(xiàn)，EGFR是單寧酸的受體蛋白[10]，單寧酸對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用主要通過調(diào)控EGFR進(jìn)行，而EGFR的磷酸化位點(diǎn)有多個(gè)，每個(gè)位點(diǎn)的磷酸化都與相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相偶聯(lián)[29]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中發(fā)現(xiàn)單寧酸對(duì)Janus激酶（Janus kinase，Jak）/STAT3信號(hào)通路也存在抑制作用。結(jié)合本研究中單寧酸通過抑制TRAF6向質(zhì)膜招募抑制EGFR/Akt信號(hào)通路，推測單寧酸對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用與EGFR的功能類似，可能存在多條信號(hào)通路的共同作用。是否除了這2 條信號(hào)通路，單寧酸對(duì)其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，例如絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）以及核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號(hào)途徑，是否存在調(diào)控作用還需要進(jìn)一步研究。進(jìn)一步比較不同信號(hào)通路在單寧酸抑制腫瘤細(xì)胞增殖中的作用對(duì)于闡述單寧酸的功能是非常重要的。

綜上所述，食品中的單寧酸能夠通過TRAF6介導(dǎo)抑制腫瘤細(xì)胞中過度激活的EGFR/Akt信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，為新型抗癌食品甚至藥物的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。這與很多研究人員利用TRAF6作為靶點(diǎn)開發(fā)新的對(duì)抗晚期癌癥的策略相類似，例如乳腺癌和前列腺癌[30]，為富含單寧的食物或者在藥物中添加單寧進(jìn)行腫瘤的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

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