山藥多糖對(duì)小鼠肝缺血再灌注損傷中的肝脾組織的保護(hù)作用＊

宋俊杰，陳 英，范軍朝，王丹丹，毛珊珊，鄭孝振，王 瑩

肝缺血再灌注損傷 （hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）是肝細(xì)胞和組織在缺血或缺氧一段時(shí)間后，恢復(fù)血流不但不會(huì)使其功能得到恢復(fù)，反而會(huì)加劇肝損害。在肝外科，為了減少手術(shù)過程中的出血，常阻斷第一肝門，這勢(shì)必造成肝缺血性損傷，而后開放肝門，又不可避免地造成肝缺血后的再灌注損傷。藥物預(yù)處理能增強(qiáng)細(xì)胞和組織對(duì)缺血再灌注損傷的抵抗力。但很多藥物具有很高的毒性，而中草藥具有安全范圍大，毒性作用小等優(yōu)勢(shì)，可以從多層次、多方面對(duì)缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用，因此成為缺血再灌注損傷所關(guān)注的研究對(duì)象。

中藥材山藥具有提高免疫功能、抗氧化、降血脂、延緩衰老等藥理作用，山藥多糖是山藥的有效成分，是從山藥塊根中提取而來的。在四氯化碳所致的小鼠急性肝損傷的模型中，肝組織的病理損害明顯減輕，同時(shí)肝組織超氧化物歧化酶（SOD）的活性明顯增加，丙二醛（MDA）的含量明顯降低［1，2］。 在卡介苗與脂多糖誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷的研究中，中劑量（60 mg/kg）及高劑量（120 mg/kg）的山藥多糖均降低了小鼠的肝指數(shù)、脾指數(shù)，但此研究未報(bào)道二者對(duì)肝組織病理學(xué)的影響［3，4］。目前，尚未發(fā)現(xiàn)山藥多糖對(duì)肝缺血再灌注損傷方面的研究。該研究通過觀察山藥多糖對(duì)小鼠肝缺血再灌注損傷肝、脾組織學(xué)的影響，為進(jìn)一步探討山藥多糖對(duì)肝缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制提供支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及材料 SPF級(jí)KM小鼠，雄性，32只，體質(zhì)量20～40 g，購自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證：SCXK（豫）2010-0002。動(dòng)物飼料20 kg，購自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。所有小鼠飼養(yǎng)于河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤分子免疫實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境清潔，溫度17～23℃，相對(duì)濕度45%～55%，光照隨晝夜變化，自由飲水、攝食。

山藥多糖，純度99%，購自楊凌慈緣生物技術(shù)有限公司。戊巴比妥鈉，規(guī)格：5 g，北京普博斯生物科技有限公司。注射用生理鹽水。

該研究的實(shí)驗(yàn)程序及方案均得到河南大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 W后，采用完全隨機(jī)的方法，分為對(duì)照組（C組，n=8）；鹽水+HIRI組（N 組，n=8）；山藥多糖中劑量+HIRI組（M 組，n=8）；山藥多糖高劑量+HIRI組（H 組，n=8）。 山藥多糖中劑量為60 mg/kg，高劑量為120 mg/kg。在缺血再灌注模型制作前分別給予不同劑量的山藥多糖溶液灌胃，1次/d，共14 d。對(duì)照組給予等量的生理鹽水，并且只開胸，不建立缺血模型。

1.2.2 動(dòng)物模型建立 所有小鼠均于手術(shù)前12 h開始禁食，可自由飲水。電子天平進(jìn)行準(zhǔn)確稱重后，以50 mg/kg的戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉。當(dāng)小鼠倒臥在地、麻醉充分后，取仰臥位，將其四肢及門牙固定于潔凈手術(shù)操作臺(tái)上，對(duì)小鼠腹部手術(shù)區(qū)域進(jìn)行常規(guī)備皮；然后絡(luò)合碘消毒，共3遍，鋪無菌手術(shù)單。取腹部劍突下至恥骨聯(lián)合上取正中切口，游離出肝胃韌帶，暴露出第一肝門，用無創(chuàng)傷微血管夾鉗夾肝蒂（包括門靜脈、肝動(dòng)脈、膽總管等）造成肝缺血。完全夾閉后，即可見肝葉的顏色由鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榘导t色至灰白、質(zhì)地變軟，腸管因瘀血轉(zhuǎn)為青紫色 （上述現(xiàn)象表明肝缺血成功建立）。準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，將肝、腸管輕柔歸位，手術(shù)切口合攏后用溫鹽水紗布覆蓋。缺血30 min后，小心取出無損傷血管夾，避免撕裂血管，松動(dòng)鉗夾的組織，使肝血供恢復(fù)，可見肝葉由蒼白轉(zhuǎn)為紅潤、腸道淤血好轉(zhuǎn)，此時(shí)表明再灌注成功建立。復(fù)位腹腔臟器，然后用絲線縫合切口，關(guān)腹、消毒，即完成小鼠肝缺血再灌注模型制作。此模型制作采用了經(jīng)典的肝缺血再灌注損傷模型的方法［13］。該研究中正常對(duì)照組只開腹，30 min后關(guān)腹。術(shù)后將所有小鼠放置于電熱毯上復(fù)蘇，蘇醒后自由飲水。

與再灌注24 h后稱重，再次以50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。于小鼠腹部正中縱行切開，充分暴露腹腔內(nèi)臟器，分別辨認(rèn)并取出完整的肝和脾，4℃生理鹽水清洗表面，用濾紙吸干表面水分，稱脾重和肝重。取右側(cè)部分肝以及腎置于4%的多聚甲醛溶液中固定后以待病理學(xué)觀察。

1.2.3 觀察和檢測(cè)指標(biāo) （1）體質(zhì)量。每次給藥前稱重，并觀察小鼠的體態(tài)改變，稱取小鼠體質(zhì)量，并記錄。（2）肝指數(shù)和脾指數(shù)。肝指數(shù)和脾指數(shù)計(jì)算公式如下：肝指數(shù)（%）=肝質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%；脾指數(shù)（%）=脾質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。 （3）肝和脾組織病理學(xué)改變。將固定后標(biāo)本經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、染色、封片等處理后，由有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)醫(yī)師在顯微鏡下觀察肝和脾的結(jié)構(gòu)變化。肝組織病理學(xué)評(píng)分參照葉秀娣等的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［2］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量 各組間及組內(nèi)體質(zhì)量比較，差異無明顯變化（P＞0.05）。

2.2 肝和脾指數(shù) 與N組相比，M組及H組的肝指數(shù)降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與C組相比，N組的脾指數(shù)增大有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與N組相比，M組和H組的脾指數(shù)均降低，但M組的脾指數(shù)降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組肝和脾指數(shù)（x±s）

2.3 肝組織病理學(xué) C組：結(jié)構(gòu)清晰，未見變性肝細(xì)胞；N組：結(jié)構(gòu)不清，核碎裂多見，胞質(zhì)空泡樣變多見；M組：大部分結(jié)構(gòu)不清，可見部分核碎裂，部分胞質(zhì)空泡樣變；H組：大部分結(jié)構(gòu)清晰，部分排列紊亂，核碎裂少見，空泡樣變少見。見圖1。

圖1 肝病理學(xué)變化（×100）

2.4 肝組織病理評(píng)分 與C組比較，N組的組織病理學(xué)評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與N組比較，M組和H組的肝組織病理評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見圖 2。

圖2 肝組織病理評(píng)分

2.5 脾組織病理學(xué) C組：正常脾組織，紅髓和白髓可分辨，未見脾竇充血；N組：脾小節(jié)結(jié)構(gòu)不清，白髓不明顯，脾竇充血；M組：可分辨出紅、白髓，部分脾小節(jié)結(jié)構(gòu)不清，部分脾竇充血；H組：可分辨出紅、白髓，脾小節(jié)結(jié)構(gòu)基本正常。見圖3。

圖3 脾組織病理學(xué)（×40）

3 討論

在肝外科，為了減少術(shù)中出血，常阻斷第一肝門，這勢(shì)必造成肝缺血，恢復(fù)血流再灌注后不但不會(huì)使其功能得到恢復(fù)，反而會(huì)加劇肝損害。藥物預(yù)先處理能增強(qiáng)細(xì)胞和組織對(duì)缺血再灌注損傷的抵抗力。山藥多糖是中藥材山藥的有效成分，是從山藥塊根中提取而來的。在四氯化碳所致的小鼠急性肝損傷模型中，山藥提取物明顯減輕了肝組織病理學(xué)損害［1］。 此外，在四氯化碳所致的肝損傷中［3］，山藥多糖保護(hù)組降低了肝體指數(shù)。山藥多糖對(duì)卡介苗與脂多糖誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷的研究中也發(fā)現(xiàn)，山藥多糖各劑量組均降低了小鼠肝指數(shù)、脾指數(shù)及血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙二醛（MDA）的含量，同時(shí)增加了還原性谷胱甘肽（GSH）的含量和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性［4］。但是，目前，尚未發(fā)現(xiàn)山藥多糖對(duì)缺血性肝損傷的保護(hù)作用。

脾是機(jī)體的重要免疫器官［5］，也是免疫細(xì)胞儲(chǔ)存和定居的主要場(chǎng)所，它由白髓、紅髓和邊緣區(qū)構(gòu)成。脾在機(jī)體的免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著巨大的作用，它是對(duì)進(jìn)入血液的抗原性物質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要部位，無論是體液免疫還是細(xì)胞免疫均可導(dǎo)致脾組織結(jié)構(gòu)的變化。故而，脾大（體積和質(zhì)量的增加）或脾指數(shù)的增長在一定程度上反映了脾結(jié)構(gòu)及功能的變化［6，7］。 肝門靜脈血液回流受阻時(shí)，可造成充血性脾腫大，脾竇擴(kuò)張，脾內(nèi)纖維組織增生。本實(shí)驗(yàn)中，由于暫時(shí)阻斷了肝門靜脈，因此造成了脾的充血腫大，與C組相比，N組的脾指數(shù)增大有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與N組相比，M組和H組的脾指數(shù)均降低，但M組的脾指數(shù)降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。

另外，脾組織病理學(xué)結(jié)果顯示，N組：脾小節(jié)結(jié)構(gòu)不清，白髓不明顯，脾竇充血；M組：可分辨出紅、白髓，部分脾小節(jié)結(jié)構(gòu)不清，部分脾竇充血；H組：可分辨出紅、白髓，脾小節(jié)結(jié)構(gòu)基本正常。以上結(jié)果表明，肝缺血再灌注損傷造成了小鼠脾病理學(xué)損傷和脾指數(shù)升高，中劑量和高劑量的山藥多糖改善了肝缺血再灌注損傷過程中的脾組織病理學(xué)損傷，且以高劑量的山藥多糖較為明顯。

肝是人體重要的解毒器官，因此保護(hù)肝有重要意義，肝指數(shù)可反映肝組織的病變情況。本研究發(fā)現(xiàn)，與N組相比，M組及H組的肝指數(shù)降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且高劑量山藥多糖組升高較明顯。很多研究均表明，山藥多糖能改善肝指數(shù)，減輕肝損傷［3，8］。山藥多糖對(duì)卡介苗與脂多糖誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷的研究表明，山藥多糖各劑量組小鼠肝指數(shù)均降低［3］。對(duì)于鎘所致的肝損傷，山藥多糖也降低了肝指數(shù)［9-11］。該研究中，肝組織病理學(xué)結(jié)果顯示，C組：肝組織結(jié)構(gòu)清晰，未見變性肝細(xì)胞；N組：肝組織結(jié)構(gòu)不清，核碎裂多見，胞質(zhì)空泡樣變多見；M組：肝組織大部分結(jié)構(gòu)不清，可見部分核碎裂，部分胞質(zhì)空泡樣變；H組：肝組織大部分結(jié)構(gòu)清晰，部分排列紊亂，核碎裂少見，空泡樣變少見。肝組織病理學(xué)評(píng)分也顯示，與肝缺血組相比，中劑量及高劑量三藥多糖組的肝組織病理學(xué)損傷均明顯減輕。另有研究表明，在四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷中，山藥多糖組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰［12］。由此，說明山藥多糖對(duì)肝組織損傷有保護(hù)作用。

總結(jié)，該研究主要從形態(tài)學(xué)方面證實(shí)在小鼠肝缺血再灌注損傷的模型中，中劑量及高劑量的山藥多糖對(duì)肝損傷和脾損傷有保護(hù)作用。

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［2017－12－06 收稿，2018－01－03 修回］