TUNEL法檢測自擬復方葛根片對老齡大鼠子宮的保護作用

陶 利，王飛飛，李云江，張淑瑜，畢云生，于燕莉，徐建江

復方葛根片［1］是原濟南軍區總醫院的醫院制劑，處方是由葛根、丹參、茵陳和延胡索四種中藥組成的，具有活血化瘀、生津養心的功效，臨床上主要用作冠心病、心絞痛以及心肌梗死等的治療。隨著年齡增長，子宮組織及功能退化，影響身體健康。該實驗通過測定血清中雌激素水平［2，3］，以及采用TUNEL法［4］，對老齡大鼠的子宮進行細胞凋亡情況檢測，來研究復方葛根片對老齡大鼠子宮的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料及儀器 復方葛根片（原濟南軍區總醫院，批號：20151212，規格：0.4 g/片）；D-半乳糖（張家港市華昌藥業有限公司，批號：15121101，純度：≥98%），0.9%氯化鈉注射液（山東齊都藥業有限公司，批號：8B15101306）；TUNEL法細胞凋亡檢測試劑盒 （批號：20161128）、Triton X-100 （批號：1286C380）、即用型 DAPI染色液（批號：20161222）均購于南京凱基生物科技發展有限公司；雌二醇（批號 CK-E30594R）、促卵泡激素 （批號：CKE30608R）、促黃體生成素（批號：CK-E30597R）、泌乳素（批號；CK-E30623R）試劑盒均購于上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 實驗動物 健康大鼠（Wistar）共40只，♀，體質量 200～250 g，動物許可證號：SCXK（魯）2013-0009，由山東大學實驗動物中心提供。實驗前，穩定飼養7 d，飼養環境：濕度 50%～70%，溫度25～27℃（室溫），自然光照。

1.2 方 法

1.2.1 D-半乳糖造模 40只大鼠，隨機分成5個組即：正常組、模型組、復方葛根片低、中、高劑量組，每組8只。以腹腔注射D-半乳糖溶液，來復制衰老模型，用藥劑量為250 mg/kg·d，D-半乳糖溶液由0.9%生理鹽水配制而成。正常組給予相同體積的生理鹽水。同時，復方葛根片高、中、低劑量組分別給予 1.35 g/kg、0.90 g/kg、0.45 g/kg的劑量， 給藥劑量按中藥藥理研究方法學計算［5］，藥品臨用前加純化水溶解，給藥劑量：10 ml/kg；正常組與模型組灌胃給予等量的純化水。連續用藥8周，稱量大鼠的體質量，1次/7 d，以便調整給藥劑量。

1.2.2 各組大鼠指標檢測 末次給藥以后，各組大鼠12 h內禁食、不禁水，麻醉，腹腔靜脈取血，4℃離心（離心半徑為 5 cm，3 000 r/min）20 min，采集血清，-20℃保存，備用；摘取子宮，冰生理鹽水清洗，切割稱重，-80℃保存，備用。按照試劑盒說明書操作測定血清中雌二醇（E2）濃度、促卵泡激素（FSH）濃度、促黃體生成素（LH）濃度、泌乳素（PRL）濃度，并根據試劑盒說明書，對子宮切片進行TRITC染色，檢測細胞的凋亡情況。

1.2.3 圖像采集與分析 采用熒光顯微鏡觀察各組大鼠的子宮組織切片，并采用數字成像系統進行拍照。利用Image Por-plus6.0圖像分析軟件，計數陽性細胞和區域內總細胞數量，計算陽性細胞所占百分比，即凋亡指數（apoptotic index，AI）。

1.3 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件對所測得得數據進行統計分析。所有數據均以x±s表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 復方葛根片對血清E2、FSH、LH、PRL的影響與正常組比較，模型組大鼠血清E2濃度明顯降低，FSH、PRL、LH 濃度顯著升高（P＜0.01）；衰老模型建造成功；與模型組比較，復方葛根片各用藥劑量組大鼠 E2 濃度明顯升高（P＜0.05），FSH、PRL、LH濃度顯著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。 見表 1。

表1 對去卵巢更年期大鼠血清E2、FSH、LH、PRL的影響（x±s，n=8）

與正常組比較，模型組大鼠血清E2濃度明顯降低，FSH、PRL、LH 濃度顯著升高（P＜0.01）；衰老模型建造成功；與模型組比較，復方葛根片各用藥劑量組大鼠 E2 濃度明顯升高（P＜0.05），FSH、PRL、LH 濃度顯著顯著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。

2.2 子宮細胞凋亡檢測結果 圖1中紅色熒光代表凋亡細胞。陽性組（A）為陽性對照組（通透操作之后，陽性片單獨滴加100 μl DNaseⅠ反應液，37℃，處理30 min），全部顯示為紅色熒光，表示所有的細胞均被染色；陰性組（B）為陰性對照組（通透之后直接進行檢測），全部不顯示熒光；與陽性組（A）和陰性組（B）相比，模型組（C）、正常組（D）、復方葛根片高、中、低劑量組（E、F、G）中均顯示紅色熒光，表明該實驗結果有效。與正常組（D）相比，模型組（C）熒光明顯增強，熒光區域明顯增大，且呈點線狀分布，細胞凋亡指數（AI）明顯升高（P＜0.05），表明造模成功。與模型組（C）相比，復方葛根片高、中、低劑量組（E、F、G）中紅色熒光均顯著減弱，熒光區域減小，呈星點狀分布，細胞凋亡指數（AI）明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），差異顯著，有統計學意義。其中低劑量組（G）中熒光比高劑量組（E）相對較多且明亮，高劑量組（E）中熒光點最少，幾乎不可見。表明復方葛根片有明顯的抑制衰老大鼠子宮細胞凋亡的作用。見圖 1，表 2。

圖1 各組大鼠肝臟組織細胞凋亡檢測結果（×200）

表2 各組大鼠子宮細胞凋亡率結果（n=8，x±s）

3 討論

雌激素是促進女性附性器官成熟及第二性征出現，并維持正常性欲及生殖功能的激素。隨著年齡的增長，雌激素的水平會不斷發生變化［6，7］。 老齡大鼠由于卵巢功能的退化，E2水平會明顯降低，而雌激素對垂體促性腺激素的分泌和合成呈負反饋作用。雌激素水平的下降，誘導下丘腦弓狀核和室旁核脈沖式分泌促性腺激素釋放激素至門脈循環，進而刺激垂體釋放FSH和LH增加，從而促進PRL的分泌。實驗研究結果顯示，模型組中E2濃度明顯下降，FSH、LH、PRL濃度明顯升高，表明衰老模型造模成功；與模型組相比，復方葛根片各用藥組中E2濃度升高，FSH、LH、PRL濃度出現不同程度的下降。表明復方葛根片能有效調節雌激素水平。

通過熒光顯微鏡觀察，對子宮組織切片進行TUNEL法［8］染色，其細胞凋亡的檢測結果顯示，模型組中顯示大量的明亮熒光，表明凋亡細胞數量增多；與正常組相比，模型組中熒光點明顯增多且光點密集，凋亡指數（AI）明顯增加，說明通過D-半乳糖制造衰老模型［9］，造模成功。復方葛根片高、中、低劑量組切片中熒光點減少，凋亡指數（AI）與模型組相比顯著降低。表明復方葛根片能夠抑制老齡雌性大鼠子宮中凋亡細胞的產生，延緩子宮衰老。

以上數據表明復方葛根片能有效抑制子宮細胞凋亡，并調節雌激素水平，起到延緩衰老，保護子宮的作用。

［1］于燕莉，梁愛君，張莉，等.復方葛根片的質量標準研究［J］.解放軍藥學學報，2009，25（6）：524-526.

［2］周智君，俞遠京，丁志剛，等.大豆異黃酮對老齡大鼠雌激素水平和子宮雌激素受體表達的影響［J］.中國實驗動物學報，2009，17（4）：288-291.

［3］常偉勤，宋昕恬，孟令儀，等.人參粉對長期喂養去卵巢大鼠內分泌功能影響初探［J］.中國實驗診斷學，2017，21（4）：698-701.

［4］郭曉紅，劉立新.AnnexinⅤ/PI流式細胞分析法和TUNEL法檢測肝細胞凋亡的對比研究［J］.山西醫科大學學報，2008，187（5）：476-479.

［5］陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.第2版.北京：人民衛生出版社，2006：31.

［6］戚本玲，戚本明.葛根提取物對正常及去勢大鼠血清雌激素水平影響的研究［J］. 中國中醫藥雜志，2002，27（11）：850-851.

［7］王玉雙，張國瑞，劉艷君，等.大豆異黃酮對女性圍絕經期綜合征及性激素的影響［J］. 中國綜合臨床，2006，22（1）：86-88.

［8］張素閣，王飛飛，張云凱，等.TUNEL法檢測復方葛根片對衰老模型大鼠肝臟細胞的保護作用［J］.解放軍藥學學報，2017，33（4）：345-347.

［9］李樹梅，盧勝明，康峰，等.衰老動物模型的研究進展及應用［J］.中國老年學雜志，2011，31（19）：3869-3872.

［2017-12-29收稿，2018-01-25修回］