Mirco-CT對納米細菌大鼠腎結石的動態觀測＊

郝志強，王勤章，倪 釗，錢 成，申茂磊，錢 彪

腎結石一直以來都是泌尿外科的常見病、多發病，根據我國2010年全國人口普查資料顯示，校正后的中國成人腎結石患病率為5.8%，其中男性患病率為6.5%，女性患病率為5.1%。臨床上對于腎結石這一疾病的研究從未中斷，大都通過構建腎結石動物模型，對其病因學進行探索。既往動物模型的構建大多采用乙二醇、氯化銨等傳統造模方式，對模型腎功能損害較大。本課題組前期發現腎結石患者患側中段尿培養納米細菌陽性，而健側陰性，納米細菌（nanobacteria，NB）可能是腎結石發病的原因之一，為驗證NB與腎結石的關系。本課題采用NB誘導Wistar雄性大鼠，成功制備了腎結石模型，而后，利用目前在探索高密度物質中先進的手段——微計算機斷層掃描技術（micro computed tomography，mirco-CT）［1］，對 Wistar大鼠腎結石模型進行動態觀測，實時記錄模型體內結石的形成發展過程，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物：選取Wistar雄性大鼠60只，購自新疆醫科大學實驗動物中心，SPF級［合格證號SCXK（新）2013-0001］，兩組大鼠均先適應性飼養1周，標準飼料喂養，飼料來源：石河子大學實驗動物中心。

實驗器械：多功能光學顯微鏡及圖像采集系統（BX40， 日本 Olympus公司）、Mirco-CT （sky-scan 1176，比利時 Antwerpen）。

實驗試劑：納米細菌懸濁液、0.9%生理鹽水等。

1.2 方 法

1.2.1 納米細菌的制備 納米細菌來源于腎結石患者清潔中段晨尿，收集標本后提取并培養，具體操作如下：收集標本5 ml，生理鹽水稀釋2倍后濾器過濾、離心取管底液1 ml，加入DMEM及熱滅活胎牛血清培養，5%CO2，37℃，28～30 d 換液 1 次，培養6～8周，30 d換液一次。篩選出無污染的標本制成NB懸液。

1.2.2 動物模型的建立及實驗取材 將60只SPF級Wistar雄性大鼠隨機分為納米細菌組（尾靜脈注射1.2 ml NB懸液，30只）和對照組（尾靜脈注射1.2 ml生理鹽水，30只），共計處理10 W，每周每組處死3只，并取兩側鮮活腎標本，進行檢測。

1.2.3 Mirco-CT掃描 將獲得的標本固定放置在放射源和攝像頭之間并使標本在觀察通道范圍內可見，然后設置觀察通道沿垂直長軸作0.9°至180°旋轉，在整個掃描視野范圍中，使用mirco-CT對固定后腎進行掃描，在skyscan軟件系統下設置如下掃描條件：功率 8 W、電壓 30 kV，電流 300 μA，分辨率 35 μm 2000×1336，Filter=0.5 mmAL，觀察腎整體輪廓及腎中腎皮質及腎髓質是否存在高密度結石樣物質，并進行拍照記錄及三維平面重建，若雙側標本均同時出現高密度區，僅統計1次，計數10 W內每周檢測到的高密度影個數。

1.2.4 病理組織學檢查 取得標本后，依次經過固定、脫水透明、浸蠟包埋、切片貼片、脫蠟染色、脫水透明、封固等步驟，制得Wistar大鼠NB腎結石模型病理切片，在光學顯微鏡下觀察晶體的形成過程，依據相關文獻提供的腎結晶分級判定標準進行統計，0級記為陰性，Ⅰ～Ⅳ級記為陽性，進行綜合、統計。

1.3 統計學方法 實驗所得數據，應用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析。計數資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 mirco－CT檢查結果 動態觀測1～10 W兩組所獲得標本，對照組大鼠腎外周輪廓清晰，邊緣光滑無毛糙；三視圖圖像中腎皮質、腎髓質及腎盂輪廓清晰可見，均未見高密度影，見圖1。納米細菌組大鼠第6周起腎可見高密度區，顆粒樣高密度影分布于腎實質中，三視圖圖像可見高密度顆粒狀影隨機分布于腎實質的各截面中，見圖2。截至第10周末，納米細菌組大鼠腎高密度影檢出4只（陽性率13.3%），對照組未檢出。

圖1 對照組micro-CT檢測結果

圖2 納米細菌組micro-CT檢測結果

2.2 肉眼及解剖顯微鏡觀察 取大鼠雙側腎標本，肉眼觀，對照組大鼠腎表面光滑，剖面呈現暗紅色，皮髓結構清晰，未見明顯斑點顆粒；納米細菌組從第4周開始，部分腎較對照組略有增大，剖面呈紅褐色，髓質呈淺紅色，皮髓結構清晰，腎盞及腎盂良好；第6周以后納米細菌組部分腎皮髓結構尚清晰，但有少量散在淡黃色顆粒沉積在腎組織中，觸之有沙礫感。鏡下觀測，對照組無異常，納米細菌組可見晶體自腎盂向周圍呈點狀分布。

2.3 病理組織學檢查結果 動態觀測1～10 W兩組Wistar大鼠腎標本，對照組大鼠腎內無晶體沉積，未見明顯病理學改變（圖3）。納米細菌組大鼠自第4周起，其腎病理切片可見灰白色晶體，這些晶體主要分布于遠曲小管、近曲小管及部分腎小球，形態不一，呈散點狀分布，部分晶體相互連接成片或成團分布（圖4）。10 W時計數，納米細菌組大鼠腎晶體陽性11只 （陽性率36.7%），對照組均為陰性；截至第10周末，納米細菌組大鼠腎晶體陽性率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.001）。

圖3 對照組

圖4 納米細菌組

3 討論

腎結石是泌尿外科診療中的常見病之一，治療手段多種多樣，各種治療方法，很大程度上均可以緩解患者的病痛，但該疾病較容易復發。有研究表明，經體外沖擊波碎石技術治療后的泌尿系結石患者的結石復發率隨著時間增長而有所升高，其中第1年復發率為6.7%，至第5年則增長到41.8%［2］。面對如此情況，眾多科研工作者積極致力于腎結石病因學的研究，在實驗設計時，大都采用構建動物模型這一方式。以往多采用乙二醇、氯化銨進行誘導實驗動物，構建腎結石模型，但這種方式對腎功能損傷較大，成石較快，不利于進行動態監測。因此，設計、建立與人類腎結石成石過程相類似的動物模型，在相對緩慢的成石過程中，動態觀測研究，對于探討腎結石的發病機制，預防和延緩結石形成，尋找防治腎結石的藥物等方面就有重要的意義，據目前的資料顯示，NB是人體內唯一可以產生羥基磷灰石的生物，探究其在結石形成過程中的機制，成為當前解決結石形成這一問題的新方向。

NB是芬蘭科學家Ciftcioglu等［3］在哺乳動物細胞培養時發現的一種具有細胞毒作用的生物被膜的生物，并在此后檢測出該生物被膜中包含了一種可能是含有基因序列為16sr RNA的顆粒物質［4］。

隨著對納米細菌各項生物學特性的不斷了解，人們發現NB在泌尿系結石的發生發展過程中扮演著重要角色，NB所特有的生物礦化功能［5］在臨床許多鈣化性疾病中都得到了有效驗證，NB作為鈣化的核心［6，7］，并進一步促進了鈣化的發展。 并且國內外眾多學者通過免疫熒光、鈣染色、相差顯微鏡、電鏡等方法在人體體液及許多組織器官中檢測到了納米細菌的存在，NB作為礦化反應的始作俑者，在吸引并聚集的同時，還能夠侵入并破壞腎集合管的腎乳頭細胞和腎小管上皮細胞，形成結晶核心，這種晶體核心作為常見的結石前體，最終誘發結石形成［8，9］。

由此可見，結石病與NB之間的確存在著千絲萬縷的聯系，圍繞二者的研究也在不斷開展，然而以往的研究更多關注于納米細菌對腎小球損害的微觀層面。缺乏從析出結晶到聚結為大體結石的宏觀動態觀測，如此，尋求一種更加直觀立體的檢測手段，來實時動態監測結石的發生發展過程，亟待完善。

mirco-CT又稱微型CT、顯微CT，是一種非破壞性的3D成像技術，可以在不破壞樣本的情況下清楚了解樣本的內部顯微結構。它與普通的臨床CT相比，前者采用錐形X線束，這不僅能夠獲得真正各向同性的容積圖像，提高空間分辨率（可達微米級別），提高射線利用率，而且在采集相同3D圖像時速度遠遠快于普通CT。mirco-CT的高速發展主要應用于骨組織的三維定量分析［10］，其觀察和測量骨組織相對于傳統的組織切片技術具有明顯的優勢［11-13］。同理，結石也具有高密度物理特性，因此在既往研究的基礎上，筆者大膽建立納米細菌Wistar大鼠腎結石模型，利用mirco-CT技術，建設結石模型三維立體影像學資料，動態監測體內腎結石動態發生發展過程，從宏觀角度進一步為研究NB形成結石提供更加直觀立體的數據支持。同時與病理組織學檢查結果進行橫向比較，微觀與宏觀兩大層面，雙管齊下，為尋求結石形成機制提供新思路。

筆者將mirco-CT結果同HE染色結果進行比較，數據分析得，對照組mirco-CT未檢測到高密度影，HE切片亦未檢測到病理學改變。納米細菌組納米細菌Wistar大鼠腎結石模型mirco-CT自第7～10周，共計檢測到高密度影4只，HE切片染色技術顯示，第4周及第6～10周，共計11只晶體陽性標本。采用篩檢試驗的評價這一 “金標準”，對mirco-CT與病理組織學檢驗兩種技術進行綜合評價，就其靈敏度、特異度、假陰性率、假陽性率及其Kappa值進行計算，得出Kappa值≈0.4199，一致性較差。探究其中原因，總結如下：HE染色病理切片的觀察，是在微觀層面上，就腎病理學改變進行檢測，得出的數據反應腎小管上皮細胞的病理損傷程度，而mirco-CT是在宏觀角度，從結晶積累形成結石后，動態記錄結石的發生發展過程，由于NB在造模過程中，因其自身因素（納米細菌生長緩慢，新陳代謝率為普通細菌的萬分之一）導致結石形成緩慢，部分標本未檢測到，可能是造模周期不足所致［14］，另外，結石的發生發展是一個動態過程，前期結晶數量少，尚未形成大的片狀或團狀，難以檢測到結石高密度影，從而出現假陰性的可能。對于mirco-CT技術，筆者經驗尚且不足，參數設置等需要進一步調整。

HE染色切片在微觀角度更能揭示納米細菌對腎小管上皮的損傷程度，mirco-CT在另一個層面，構建了一個三維立體模型，在不破壞大體標本的情況下，探究其內在微觀結構，更加的直觀與立體，可以為結石疾病的發生機制提供更為翔實的物理數據，二者相輔相成，共同探討納米細菌在腎結石形成中的作用，其效果更加優越。納米細菌為結石病病因學的發展提供了新方向，先進的科學技術諸如mirco-CT及病理組織切片技術等，為“新方向”保駕護航，但究其內在機制，仍然不甚明了，期待進一步研究。

［1］ RULE AD，BERGSTRALH EJ，LI X，et al.Kidney stones and the risk for chronic kidney disease［J］.Clin Am Soc Nephrol，2009，4（4）：804-811.

［2］ SOMMER AP，ORON U，PRETORIUS AM，et al.A preliminary investigation into light-modulated replication of nanobacteria and heart disease［J］.Clin Laser Med Surg，2003，21（4）：231-235.

［3］ CICFTIOGLU N，KURONEN L，AKERMAN K，et al.A new potential htreat in antigen and antibody products：Nanobacteria.Vaccines97［M］.Brown F，Burton D，Dohertyt P，Mekalanos，and Norrby E.Cold Spring Harbor Laboratory press，Cold Spring Harbor，1997：99-103.

［4］ KAJANDER EO，CIFTCIOGLU N.Nano bacteria as extremophiles［J］.Proc SPIE Int，1999，3755（1）：106-112.

［5］ KAJANDER E O，CIFTCIOGLU N.Nanobacteria：an alternative mechanism for pathogenic intra-and extracellular calcification and stone formation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（14）：8274-8279.

［6］胡衛國，王曉峰，徐濤，等.納米細菌大鼠腎結石模型初步建立及成石因素分析［J］．北京大學學報（醫學版），2010，42（4）：433-435.DOI：10.3969/j.issn.1671-167X.2010.04.016.

［7］粟宏偉，王杰，朱永生，等.鈣化性納米微粒致大鼠腎結石模型的構建［J］．重慶醫學，2016，45（3）：310-312，316.DOI：10.3969/j.issn.1671－8348.2016.03.007.

［8］ KHULLAR M，SHARMA SK，SINGH SK，et al.Morphological and immunological characteristics of nanobacteria from human renal stones of a north Indian population［J］.Urol Res，2004，32（3）：190-195.

［9］ SHIEKH FA，MILLER VM，LIESKE JC.Do calcifying nanoparticles promote nephrolithiasis?A review of the evidence［J］.Clinical Nephrology，2009，71（1）：1.

［10］姜玲，金東春，黎衛星，等.顯微CT在口腔種植研究領域中的應用［J］．中華臨床醫師雜志（電子版），2009，3（11）：71-74.

［11］吳興，湯光宇.骨質疏松骨髓微環境的影像研究進展［J］.國際醫學放射學雜志，2016，39（4）：390－394.DOI：10.19300/j.2016.Z3898.

［12］ RITMAN EL.Micro-computed tomography-current status and developments［J］．Annu Rev Biomedl Eng，2004，6（1）：185-208.

［13］ SNOEKS TJ，KAIJZEL EL，QUE I，et al.Normalized volume of interest selection and measurement of bone volume in micro CT scans［J］．Bone，2011，49（6）：1264－1269.DOI：10.1016/j.bone.2011.09.037.

［14］ DE OLIVEIRA R C，LELES C R，NORMANHA L M，et al.Assessments of trabecular bone density at implant sites on CT images［J］.Oral Surgery Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2008，105（2）：231-238.

［2017－11－17 收稿，2017－12－12 修回］