以玉米蛋白粉為主要原料生產發酵飼料菌種的研究

江成英 ， 王 松 ， 張文學 ， 韓國棟 ， 郭宏文 ， 韓 穎 ， 祝露露

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學農產品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006）

玉米蛋白粉也稱為玉米麩質粉，是加工玉米淀粉的副產物之一，主要成分為玉米醇溶蛋白和玉米黃色素（趙文揚等，2015），其中醇溶蛋白的含量可高達45%，而水溶性蛋白僅占3%左右，因而玉米蛋白粉水溶性特別差，且所含蛋白質缺少賴氨酸、色氨酸等必需氨基酸，所以其生物學價值低（Shukla，2001），將其用于飼料工業，存在蛋白質消化利用率低的問題。采用微生物發酵的方法可提高玉米蛋白的可溶性，從而提高其作為飼料的動物消化利用率，促進玉米蛋白質資源的有效利用（王燕等，2014）。

生產微生物發酵飼料的首要問題是選擇合適的菌種。目前微生物發酵飼料最常使用的菌種為酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌、鏈球菌屬及部分霉菌等（劉艷新，2017）。本研究以發酵飼料中可溶性蛋白為指標，篩選出酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌的三菌組合用來生產玉米蛋白粉發酵飼料。

1 材料與方法

1.1 主要材料及設備 菌種：熱帶假絲酵母、啤酒酵母、凝結芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜酸乳酸桿菌、嗜熱乳酸桿菌均由齊齊哈爾大學生物工程實驗室提供。

原料：玉米蛋白粉、麩皮均為市售。

試劑：葡萄糖、胰蛋白胨、酵母浸出物、氯化鈉、牛肉膏、瓊脂、磷酸氫二鉀、檸檬酸二銨、醋酸鈉、吐溫 80、七水合硫酸鎂、四水合硫酸錳、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、三氯乙酸等均為國產分析純。

設備：電熱恒溫培養箱 （上海躍進醫療器械廠），PHS-25數顯pH計 （上海精密科學儀器有限公司），超凈工作臺（上海智城分析儀器有限公司），BS224S型電子天平（北京塞多利斯儀器廠），手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠），紫外可見分光光度計（日本島津儀器廠）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基的配制 篩選培養基：5 g玉米蛋白粉、pH中性，2 g瓊脂，定容至100 mL，121℃蒸汽滅菌；發酵培養基：35 g玉米蛋白粉、15 g麩皮、50 g水，pH中性，121℃蒸汽滅菌；PDA培養基：取約200 g的馬鈴薯，去外皮后切成較碎小塊，煮沸約40 min后進行過濾，將濾液配成1000 mL的溶液，葡萄糖20 g，pH自然，固體培養基加入2%瓊脂；NA培養基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉3.0 g、氯化鈉5.0 g、蒸餾水1000 mL，pH 7.3，固體培養基加入2%瓊脂；MRS乳酸細菌培養基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏 10.0 g、酵母膏 5.0 g、檸檬酸氫二銨 2.0 g、葡萄糖 20.0 g、吐溫 80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀 2.0 g、硫酸鎂 0.58 g、硫酸錳0.25 g、瓊脂 18.0 g、蒸餾水 1000 mL，pH 6.5，固體培養基加入2%瓊脂。

1.2.2 菌種活化 在高壓蒸汽滅菌鍋內對已配制的培養基進行滅菌，分別將熱帶假絲酵母、啤酒酵母接種到PDA培養基，凝結芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌接種到NA培養基，嗜酸乳酸桿菌、嗜熱乳酸桿菌接種到MRS乳酸細菌培養基上，放入培養箱內30℃下培養48 h備用。

1.2.3 平板培養 首先確定菌種是否對玉米黃粉具有利用能力。將活化好的八株菌在篩選培養基上劃線培養，每菌三個平行，在30℃恒溫條件下培養48 h，觀察各菌種的生長情況。

1.2.4 發酵試驗 將能利用玉米蛋白粉的菌種活化后接種于固體發酵培養基上，置于30℃條件下發酵一定時間，測定其可溶性蛋白含量。

1.2.5 正交試驗 以篩選出的三種菌株另加一空列為因素，接種量為水平，設計四因素三水平（L934）的正交試驗。三種菌株分別活化后，按一定比例接種于發酵培養基中，30℃發酵144 h，根據所測定的發酵玉米蛋白粉飼料中可溶性蛋白含量，對配合菌株的接種比例進行確定。

1.2.6 主要測定方法 可溶性蛋白含量的測定采用福林酚法（王永華，2010）。

2 結果與討論

2.1 菌種利用玉米蛋白粉能力測定 將待選的八種菌株分別在含有5%玉米蛋白粉的篩選固體培養基上劃線培養，根據其生長狀況確定其對玉米蛋白粉的利用能力。結果表明，本研究所采用發酵飼料常用的八種菌種在篩選培養基上均長勢良好，說明都具有較強的利用玉米蛋白粉的能力，故這八種待選菌株均可作為發酵玉米蛋白粉發酵菌種。

2.2 發酵用配合菌株的選擇 由于所選用的八種菌株均能利用玉米蛋白粉，故都用于發酵用配合菌株的篩選。將其分別活化后，以5%的接種量接入發酵培養基中，置于30℃恒溫培養箱中發酵培養。每24 h取樣測定其中的可溶性蛋白含量，以確定各種菌株發酵玉米蛋白粉的能力。結果見表1。

表1 各菌種發酵玉米蛋白粉的可溶性蛋含量%

據表1可以看出，所選用的八種菌株接入發酵培養基后，隨著時間的延長，發酵飼料中的可溶性蛋白含量均逐步提高。其中芽孢桿菌中枯草芽孢桿菌發酵的效果最好，在144 h時可溶性蛋白含量為10.44%；酵母菌中熱帶假絲酵母菌發酵的結果較好，在144 h時可溶性蛋白含量為9.48%；乳酸桿菌中嗜熱乳酸桿菌發酵的結果最好，在144 h時可溶性蛋白含量為9.04%。

目前微生物發酵飼料最常使用的菌種為酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌、鏈球菌屬及部分霉菌等，飼料酵母可產多種動物所需的消化酶，對營養物質的消化吸收起著重要作用，同時酵母菌具有濃烈的酵母香味，對家畜增加食欲、增強消化吸收等有一定作用（Puniya，2015）；芽孢桿菌具有較強的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性，可明顯提高飼料利用率，還可以消耗大量的氧氣，維持腸道厭氧環境，抑制致病菌的生長，維持腸道正常生態平衡，增強機體免疫力（李春鳳，2013）；乳酸菌可以提高飼料的品質，并能直接促進動物生長，改善消化道微生態環境，調節消化道免疫系統，具有替代含抗生素飼料的潛能（王芳芳，2016）。每種菌在發酵飼料中都有不同的功效，因此混合發酵效果要優于單菌發酵。

綜上所述，選擇枯草芽孢桿菌、熱帶假絲酵母和嗜熱乳酸桿菌做為發酵玉米蛋白粉飼料的配合菌株。

2.3 配合菌株比例的確定 將所選出的三種配合菌株進行正交試驗，以確定菌種的最佳比例。結果見表2。

表2 正交試驗設計與試驗結果

由表 2 分析可知，RB＞RC＞RA，即因素的主次順序依次為枯草芽孢桿菌（因素B），熱帶假絲酵母菌（因素C），嗜熱乳酸桿菌（因素A）；各因素水平的比較：KB3＞KB2＞KB1，KC2＞KC1＞KC3，KA3＞KA1＞KA2，由此得出利用枯草芽孢桿菌、熱帶假絲酵母和嗜熱乳酸桿菌發酵玉米蛋白粉飼料的最佳接種比例組合為A3B3C2，即嗜熱乳酸桿菌：枯草芽孢桿菌：熱帶假絲酵母菌=3∶3∶2，通過驗證試驗，在此接種比例下，發酵玉米蛋白粉中可溶性蛋白含量達到最高為14.47%，較發酵之前的3.04%提高了11.43%。

3 結論

通過平板培養和發酵試驗相結合的方法，篩選出以玉米蛋白粉為主要原料生產發酵飼料的菌種為嗜熱乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母；利用正交試驗確定所用三種菌株的比例為嗜熱乳酸桿菌：枯草芽孢桿菌：熱帶假絲酵母=3∶3∶2。

[1]劉艷新，劉占英，倪慧娟，等.微生物發酵飼料的研究進展與前景展望[J].動物營養，2017，2：15 ～ 22.

[2]李春鳳，林顯華，谷巍.枯草芽孢桿菌在飼料生產及環境防治中的應用[J].中國飼料，2013，1：10 ～ 12，17.

[3]王燕，文奇男，陳偉康，等.納豆芽孢桿菌和好食性脈胞霉混合固態發酵玉米黃粉飼料[J].飼料工業，2014，35（15）：19 ～ 23.

[4]王永華.食品分析[M].北京：中國輕工業出版社，2010：127～128.

[5]王芳芳，刁華杰，夏九龍，等.乳酸菌及其發酵飼料在動物生產中的應用[J].飼料研究，20161，1：15 ～ 19.

[6]趙文揚，康明麗，郭小磊，等.微波輔助提取玉米蛋白粉中的玉米黃色素研究[J].中國飼料，2015，9：14 ～ 18.

[7]Puniya A K，Salem A Z M，Kumar S，et al.Role of live microbial feed supplements with reference to anaerobic fungi in ruminant productivity：A review[J].Journal of Integrative Agriculture，2015，14（3）：550 ～ 560.

[8]Shukla R，Chenyan M.Zein：the industrial protein from corn[J].Industrial Crops Products，2001，13（3）： 171 ～ 192.