Wnt-1/β-catenin通路在亞硒酸鈉抑制人增生性瘢痕成纖維細胞體外增殖過程中表達研究

楊陸濤 張守忠 潘擁軍 曾元臨

目前對生物體的演變和發(fā)展規(guī)律研究已經(jīng)成為熱點，而作為在調(diào)控細胞生長、發(fā)育和分化過程中起重要作用的Wnt/β-catenin信號通路也得到越來越多的研究。本課題主要研究亞硒酸鈉對人增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）成纖維細胞（Fibroblasts，F(xiàn)B）體外增殖的影響，前期研究已發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉在體外可以抑制人HSFB的增殖，顯示可以明顯抑制FB中的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達[1-3]。還沒有相關(guān)文獻顯示亞硒酸鈉在抑制人HSFB增殖相關(guān)機制方面的報道，為了進一步明確亞硒酸鈉對人HSFB抑制的分子機制，決定首先從Wnt-1/β-catenin信號通路在亞硒酸鈉作用后的人HSFB中的變化方面研究入手，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 取自2016年1-3月在九江市第一人民醫(yī)院燒傷整形科行HS整形手術(shù)的患者瘢痕組織（年齡4～12歲，3例患者的瘢痕組織，其身體健康、近期未使任何抗瘢痕藥物、瘢痕組織處于穩(wěn)定期且無惡變，瘢痕用于研究實驗均征得患者家屬的知情同意）。設(shè)置試驗組與和對照組，試驗組分為A、B、C、D、E組，每組3份標本，分別加入等量含2.5、5、10、20、40 μmol/L濃度的亞硒酸鈉10%胎牛血清的培養(yǎng)基，對照組加入等量的10%胎牛血清培養(yǎng)基（即0 μmol/L濃度的亞硒酸鈉）。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 亞硒酸鈉粉末（Sigma，美國），DMEM（Hyclone，美國），胎牛血清（Hyclone，美 國 ）， 胰 蛋 白 酶（Hyclone， 美 國 ），PBS液（Hyclone，美國），Wnt-1一抗（中杉金橋，北京），β-catenin（中杉金橋，北京），PV-9000試劑盒（中杉金橋，北京），DAB試劑盒（中杉金橋，北京）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo-BB15，德國），臺式離心機（Allegra，美國），超凈工作臺（蘇干，中國），微量電子秤（上海儀展，中國），倒置顯微鏡及照相分析系統(tǒng)（CX 40，Olympus，日本），-20 ℃低溫冰箱（Siemens，德國）。

1.2.2 FB體外培養(yǎng) 采用林尊文等[2]的改良組織塊貼壁結(jié)合胰蛋白酶消化法體外培養(yǎng)，將HS剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，經(jīng)過胰酶消化后再鋪于培養(yǎng)瓶底部貼壁，F(xiàn)B從組織塊中爬出增生，連續(xù)培養(yǎng)后取第4代用于實驗研究。

1.2.3 細胞免疫組化法測細胞內(nèi)Wnt-1、β-catenin蛋白的表達 細胞爬片的制備以及免疫組化實驗采用楊陸濤等[1]前期研究細胞免疫組化法檢測FB內(nèi)TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原同樣方法。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗；組間比較采用單因素多樣本均數(shù)SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HS組織塊培養(yǎng)FB 前3 d未見細胞，第4天可見單個呈梭形狀細胞分布于組織塊周圍，第7天可見較多細胞整齊排列于瘢痕塊周圍，第15天時細胞基本爬滿瓶底，將瘢痕塊移出繼續(xù)培養(yǎng)，瓶底細胞按1∶2傳代培養(yǎng)，取第4代用于進一步實驗研究。

2.2 細胞免疫組化法檢測Wnt-1、β-catenin的表達情況 亞硒酸鈉的濃度在0～40 μmol/L，隨著濃度的遞增，F(xiàn)B的總數(shù)在逐漸減少，細胞形狀也在發(fā)生不同的變化，在40 μmol/L的濃度時FB處于抑制狀態(tài)，細胞核出現(xiàn)多形性，較多細胞出現(xiàn)核碎裂甚至死亡；隨著濃度的遞增FB內(nèi)所表達的Wnt-1和β-catenin蛋白表達的陽性細胞數(shù)逐漸減少，陽性率逐漸降低。見表1和圖1、2。

表1 各組間各指標免疫組織化學(xué)結(jié)果分析（±s）

表1 各組間各指標免疫組織化學(xué)結(jié)果分析（±s）

注：n=3，同一個載玻片中均取3個相對分布均勻的視野便于統(tǒng)計；*與對照組比較，P＜0.05；#與A組比較，P＜0.05；△與B組比較，P＜0.05；○與C組比較，P＜0.05；●與D組比較，P＜0.05。

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圖1 不同濃度亞硒酸鈉作用后細胞內(nèi)Wnt-1蛋白變化趨勢（免疫組化，×400倍）

圖2 不同濃度亞硒酸鈉作用后細胞內(nèi)β-catenin蛋白變化趨勢（免疫組化，×400倍）

3 討論

文獻[4-8]的研究顯示，Labus和Okuse對小鼠創(chuàng)面模型及FB損傷模型的研究中均發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)面愈合初期存在Wnt信號的激活，其中Wnt-1表達活躍促進FB的增殖；Sato等[9]觀察到HS組織中β-catenin表達量顯著高于萎縮性瘢痕組織；Cheon等[10]則觀察到β-catenin在HS組織中的表達量與正常手術(shù)后瘢痕無明顯差異，但其表達持續(xù)時間卻顯著延長，因此還是說明在HS中Wnt信號通路的激活還是很明顯的；在最新的研究中Ho等[11]通過外源性干預(yù)激活Wnt/β-catenin，發(fā)現(xiàn)可以抑制高糖誘發(fā)、TGF-β1介導(dǎo)的腎纖維化；在HS或纖維化效應(yīng)細胞活化的研究中，Caraci等[12]認為TGF-β1可通過ERK途徑激活β-catenin，進而促進肺FB的表型轉(zhuǎn)化。上述的研究充分證明，Wnt信號通路在瘢痕的形成和組織的纖維化的過程中起到非常重要的調(diào)節(jié)作用，其中發(fā)揮主要作用的是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路，并且β-catenin表達的增加對通路的激活起到關(guān)鍵作用。

人HSFB的本質(zhì)是由于FB的過度增生，在細胞的增殖的過程中，可能是由于某些代謝產(chǎn)物的刺激，導(dǎo)致細胞的分裂速度過快或者某些信號通路的異常調(diào)節(jié)，導(dǎo)致細胞周期的異常，在這一點上，人HSFB和腫瘤細胞的異常增殖有一定的相似性。人HS由于組織中FB凋亡減少，繼而細胞增殖過度分泌過多的膠原和細胞外基質(zhì)是導(dǎo)致HS發(fā)生的重要機制。細胞凋亡障礙和增殖異常是人HS發(fā)生的重要機制之一，但這兩者之間并不是相互孤立的。

本實驗使用亞硒酸鈉抑制人HSFB增殖，探討Wnt-1/β-catenin信號通路在這個過程中的變化，細胞免疫組化檢測結(jié)果顯示隨著亞硒酸鈉的濃度升高，Wnt-1蛋白和β-catenin蛋白在FB中的表達均呈現(xiàn)出遞減的趨勢，同時細胞的數(shù)量也表現(xiàn)出逐漸減少的趨勢，說明隨著亞硒酸鈉的濃度增加，可能會促進FB的凋亡和抑制細胞分裂，導(dǎo)致細胞的數(shù)量的減少。在HSFB中Wnt-1蛋白和β-catenin蛋白呈現(xiàn)出比正常皮膚中的FB內(nèi)的Wnt-1蛋白和β-catenin蛋白表達增強的狀態(tài)，說明在HS形成的過程中，Wnt-1/β-catenin信號通路是一種激活狀態(tài)，可以促進FB的增殖與分化。而亞硒酸鈉中的硒可以明顯地抑制FB的增殖與分化，目前單從Wnt-1/β-catenin信號通路的研究中可發(fā)現(xiàn)，該條信號通路可以被亞硒酸鈉明顯的抑制作用，在今后的研究中，可以進一步明確亞硒酸鈉是否對其他的信號通路也存在一定程度的抑制作用。

通過本課題的研究可發(fā)現(xiàn)硒在瘢痕的抑制方面可起到一定的作用，通過未來對硒在抑制瘢痕的進一步深度研究，可以在臨床上對燒傷瘢痕的抑制發(fā)揮作用；以及近年來的研究已確證硒在人體健康中的重要性，在人體正常的生理生化活動起重要調(diào)控作用，隨著人們對硒認識的逐步加深，硒元素對人體的作用越來越大，在未來的腫瘤治療中、心血管疾病中以及在瘢痕防治中等多方面，均都會看到硒元素發(fā)揮的作用，本課題組會繼續(xù)探討硒對人HS的抑制作用機制研究。

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