AMPK蛋白對骨肉瘤MG-63細胞的影響

王江波,王春生

(沈陽軍區總醫院附屬北方醫院，遼寧 沈陽110031)

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK) 作為細胞能量代謝的調控因子，有望成為腫瘤治療的新靶點[1]。AMPK是一個由α、β、γ三個亞基構成的異源三聚體蛋白，每個亞基又分別由不同基因編碼的α1，α2，β1，β2，γ1-γ3亞型[2]。AMPK的主要上游激酶分別是鈣調激酶K(CaMKK)和抑癌激酶(LKB1)，LKB1/AMPK 途徑在殺傷腫瘤細胞方面發揮作用，包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌等[3-5]。本研究應用AMPK激動劑AICAR和AMPK抑制劑Compound C考察AMPK對人骨肉瘤細胞株MG-63凋亡的影響，探討AMPK激活誘導骨肉瘤細胞株MG-63凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

四甲基偶氮唑藍(MTT)、AICAR、 Compound C均購自美國Sigma公司,Annexin V /PI雙染試劑盒購于天津三箭生物技術有限公司。RPMI 1640、胎牛血清、胰酶購自美國Gibco公司。細胞培養箱、酶標儀購于日本三洋公司，倒置顯微鏡購于日本OLYMPUS公司，電泳和轉膜裝置購于美國伯樂，流式細胞儀購于美國BD公司。

1.2 細胞株與細胞培養

骨肉瘤MG-63細胞株購于中國科學院細胞庫。培養于RPMI1640培養基中，內含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和慶大霉素(40 U/ml)，于恒溫培養箱中培養(37℃、5%CO2)，當細胞生長至80%-90%融合時，0.25%胰酶消化傳代。當細胞生長至對數生長期時進行實驗。

1.3 MTT法檢測細胞活性

將MG-63細胞種于96孔板，密度5×103/ml，每孔加200 μl培養基，孵育24 h后，加入不同濃度藥物，作用24小時后，去上清，加入90 μl新鮮培養液及10 μl MTT溶液，培養4小時，去上清后，每孔加入二甲基亞砜100 μl，低速振蕩10 min，充分溶解結晶物。490 nm波長測定吸光度值。實驗重復 3次。

1.4 Western blotting檢測蛋白表達

經藥物作用后的MG-63細胞，加入RIPA裂解，收集細胞裂解液，進行SDS-PAGE電泳。濃縮膠濃度5%，分離膠濃度15%，電壓設置為濃縮膠80V分離膠220V，100V恒壓轉至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗膜3次，每次15 min，一抗低溫孵育過夜(Cleaved Caspase-3抗體，Cell Signaling公司，稀釋比例1∶800)，TBST洗膜3次，每次15 min，二抗室溫孵育2 h(Cell Signaling公司，稀釋比例1∶5 000)，TBST洗膜3次，每次15 min，ECL顯影。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書簡要步驟如下，胰酶消化收集細胞，PBS洗滌細胞2次，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，加入5 μl Propidium Iodide，混勻。室溫、避光、反應15 min加入200 μl結合緩沖液后通過流式細胞儀檢測進行定量評價細胞凋亡。FITC-/PI-代表正常的細胞，FITC+/ PI-代表早期凋亡細胞，FITC+/ PI+代表晚期凋亡細胞，FITC-/PI+代表壞死細胞。

1.6 統計學方法

數據分析利用SPSS16．0軟件。數據以均值±標準差表示 ，實驗數據采用ANOVA進行分析，多組均數間比較采用最小顯著差數法(LSD)，P<0.05認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 AICAR對MG-63細胞活性的影響

當用不同濃度AICAR(200、500、1 000、2 000 μM) 處理MG-63細胞24 h后，MTT法檢測細胞活性，結果如圖1所示，MG-63細胞活性呈濃度依賴性地顯著下降，當AICAR濃度到2 000 μM時，細胞活性下降到50%左右，結果表明，AICAR可降低MG-63細胞生存率。

*代表與對照組相比較有統計學差異

2.2 Compound C對MG-63細胞活性的影響

當用不同濃度Compound C(2、4、8、16 μM) 處理MG-63細胞24 h后，MTT法檢測細胞活性，結果如圖2A所示，細胞活性無顯著變化，因此我們選擇4 μM 作為Compound C安全給藥濃度。當用4 μM 的Compound C預先處理MG-63細胞2 h后，再加入1 mM的AICAR共同作用24 h后，MTT結果如圖2B所示，二者聯用組與AICAR單獨處理組相比，細胞活性明顯增加。結果提示，AMPK活性被Compound C抑制后可以改善MG-63的細胞活性。

*代表與對照組相比較有統計學差異

2.3 AMPK激動劑和抑制劑對MG-63細胞凋亡相關蛋白的影響

上述結果表明AICAR具有降低MG-63細胞生存率的作用，Compound C可以扭轉AICAR的作用。為了檢測AMPK活性的改變是否會誘導MG-63細胞凋亡，我們檢測了凋亡蛋白caspase-3及PARP蛋白表達。western blotting檢測結果如圖3A和3B所示，Compound C組(4 μM) cleaved caspase-3及cleaved PARP蛋白表達水平無明顯改變，AICAR組(1 mM)明顯上調了二者的表達，而當預先用Compound C處理后，二者聯用組的蛋白表達水平與AICAR組比較顯著降低。結果表明，AMPK活性增加誘導MG-63細胞凋亡。

*代表與對照組相比較有統計學差異，#代表與AICAR組相比有統計學差異(下同)

圖3A AICAR和(或)Compound C對MG-63細胞cleavedcaspase-3蛋白表達的影響

圖3B AICAR和(或)Compound C對MG-63細胞cleavedPARP蛋白表達的影響

2.4 AMPK激動劑和抑制劑對MG-63細胞凋亡率的影響

為進一步考察AMPK活性改變對MG-63細胞凋亡的影響，我們將MG-63細胞經過Annexin V-FITC和PI染料雙染后，進行流式細胞儀檢測。結果如圖4柱狀圖所示,Compound C組(4 μM)對MG-63細胞早期凋亡率未產生顯著影響，AICAR組(1 mM) 早期凋亡細胞占50%左右，二者聯用組的細胞早期凋亡率與AICAR組比較顯著降低。結果進一步表明AMPK活性增加可以誘導MG-63細胞凋亡。

圖4 AICAR和(或)Compound C對MG-63細胞凋亡率的影響

3 討論

骨肉瘤是常見的起源于間葉組織的惡性腫瘤。目前主要的治療手段為手術、放化療等多種治療手段，但腫瘤細胞的耐藥性，以及化療藥物的毒副作用限制了化療藥物的應用。因此開發新的化療藥物可為骨肉瘤以及其他癌癥治療開辟新的道路。研究發現，AMPK激動劑AICAR可能成為一種潛在的治療癌癥的化療藥物。它是一種腺苷類似物，目前被廣泛應用于對 AMPK 的研究領域。AICAR不僅可以抑制多種腫瘤細胞的生長,使細胞停滯于Gl期[6]，而且可能通過激活AMPK、調控P27蛋白磷酸化誘導細胞凋亡[7]。

本實驗旨在考察AMPK蛋白對骨肉瘤細胞株MG-63凋亡影響，結果表明當給與AMPK激動劑AICAR處理后，MG-63細胞細胞活性顯著降低，凋亡明顯增加。為進一步驗證AMPK是可能引起凋亡的靶蛋白，AMPK抑制劑Compound C與AMPK激動劑AICAR共同處理后， AICAR的效應被逆轉，這些結果表明，激活AMPK是導致MG-63細胞凋亡的靶蛋白之一。這與AMPK誘導腫瘤細胞凋亡的其它研究結果相吻合，AMPK導致MG-63細胞凋亡的具體機制仍有待進一步研究。

綜上所述,激活AMPK能夠誘導骨肉瘤MG-63細胞株凋亡，AMPK可能作為化療藥物的潛在作用靶點，因此AMPK激動劑有希望成為新一代骨肉瘤治療藥物。

參考文獻：

[1]牛耿明,樓文暉.蛋白激酶AMPK家族與腫瘤的關系[J].外科理論與實踐,2009(4):462.

[2]Stapleton D,Mitchelhill KI,Gao G,et al.Mammalian Amp-activated Protein Kinase Subfamily[J].Journal of Biological Chemistry,1996,271(2):611.

[3]Jun Li,Ping Jiang,Megan Robinson,et al.Ampk-β1 Subunit Is a P53-independent Stress Responsive Protein That Inhibits Tumor Cell Growth Upon Forced Expression[J].Carcinogenesis,2003,24(5):827.

[4]Xiaoqin Xiang,Asish K Saha,Rong Wen,et al.Amp-activated Protein Kinase Activators Can Inhibit the Growth of Prostate Cancer Cells By Multiple Mechanisms[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2004,321(1):161.

[5]Johannes V Swinnen,Annelies Beckers,Koen Brusselmans,et al.Mimicry of a Cellular Low Energy Status Blocks Tumor Cell Anabolism and Suppresses the Malignant Phenotype[J].Cancer Research,2005,65(6):2441.

[6]Ramandeep Rattan,Shailendra Giri,Avtar K Singh,et al.5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-d-ribofuranoside Inhibits Cancer Cell Proliferation in Vitro and in Vivo Via Amp-activated Protein Kinase[J].Journal of Biological Chemistry,2005,280(47):39582.

[7]Arnaud Besson,Mark Gurian-west,Xueyan Chen,et al.A Pathway in Quiescent Cells That Controls P27kip1 Stability,Subcellular Localization,and Tumor Suppression[J].Genes & Development,2006,20(1):47.