量子點雙色探針檢測胃腺癌中EGFR和p53的共表達

周瑋瑋,王 磊,王秋桐

(1.滄州市中心醫(yī)院,河北 滄州061001；2.滄州醫(yī)學高等?？茖W校)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，每年全球發(fā)病超過100萬例， 我國是胃癌高發(fā)國家，新發(fā)及死亡病例約占全球的40%。胃腺癌是胃癌中最常見的類型，其發(fā)生率占胃惡性腫瘤的95%。QDs法具有熒光強度高、靈敏度高、熒光穩(wěn)定性好等獨特的光學性質(zhì)[1-3]，可耐受反復的激發(fā)和長時間的觀察，更重要的是其具有吸收光譜寬而連續(xù)、發(fā)射光譜狹窄且對稱的特點，在同一激發(fā)光照射下，可進行一元激發(fā)、多元發(fā)射的同時標記，即可實現(xiàn)對多種腫瘤特異性標志物同時檢測[4-6]，為尋找多因子表達作為判斷癌癥生物學行為及預后的參考指標，國內(nèi)外學者進行了相關研究工作。Liu等[7]利用量子點對乳腺癌細胞的HER2水平和腫瘤間質(zhì)中的Ⅳ型膠原蛋白實現(xiàn)了雙色成像。He S等[8]發(fā)展了一種基于石墨烯納米材料與DNA生物分子結合的多色探針，對同一溶液中多種 DNA 靶向分子進行了快速、靈敏、高選擇性的同時檢測。唐甜等[9]采用量子點免疫組化法檢測了Bcl-2和p53 在血管瘤增生期、退化期以及正常皮膚組織中的表達。Chen H等[10]運用量子點免疫組化技術檢測肺癌組織芯片中的caveolin-1和PCNA，檢測結果更是優(yōu)于傳統(tǒng)的免疫組化。向清明等[11]利用量子點雙標探針定量分析HER-2和Ki-67在乳腺癌中的協(xié)同表達，發(fā)現(xiàn)Ki-67對乳腺癌預后不良的影響權重約為HER-2的3倍。我們利用QDs作為示蹤物同時標示EGFR、p53兩種抗體，檢測胃腺癌組織樣本中的EGFR、p53突變抗原的表達，探討QDs應用于胃腺癌組織中EGFR、p53同時檢測的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

光學顯微鏡(OLYMPUS)；正置熒光顯微鏡(BX51，OLYMPUS)；多光譜成像系統(tǒng)(Nuance Fx，CRI)。

單克隆鼠抗人EGFR抗體(1∶200，Origene公司)；單克隆兔抗人p53抗體(1∶200，Origene公司)；生物素化羊抗鼠IgG(1∶300，Origene公司)；量子點標記的鏈霉親合素QDs-SA-525(1∶50，武漢珈源量子點公司)；量子點標記的羊抗兔IgG-605 (1∶50，武漢珈源量子點公司)。

1.2 方法

1.2.1胃癌組織樣本收集 收集本院2015年1月-2016年6月胃癌組織標本78例，所有標本均由10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋后保存，實驗前進行4 μm連續(xù)切片，切片置于切片架上，于60 ℃恒溫烤箱中過夜，備用。

1.2.2HE染色 對標本逐一HE染色后，結合病歷資料和判定標準，對腫瘤進行分期和分級。

1.2.3組織標本QDs熒光雙色標記 (1)切片脫蠟：將切片依次置于3個二甲苯缸中浸泡脫蠟，分別在梯度乙醇(100%、95%、85%)中依次浸泡10 min脫苯。(2)水化：切片經(jīng)下行酒精水化，無水乙醇 5 min，95%乙醇 2次(每次2 min)，85%乙醇2 min；75%乙醇 2 min，自來水沖洗，ddH2O洗 2×2 min。(3)抗原修復：采用高壓修復法(EDTA， pH9.0)，室溫自然冷卻，自來水沖洗，ddH2O洗 2×2 min，PBS 洗滌(2×2 min)。(4) 加一抗：滴加已稀釋的一抗(鼠抗人EGFR抗體、兔抗人p53抗體)混合液，置于濕盒37℃溫箱中孵育2 h，PBS-T洗滌(3×5 min)。(5)加生物素化二抗：加入已稀釋的生物素化羊抗鼠IgG，置于濕盒37℃溫箱中孵育30 min，PBS-T洗滌(3×5 min)。(6)熒光標記：滴加已稀釋的QDs-SA-525和量子點標記的羊抗兔IgG-605，37 ℃濕盒中孵育60 min，PBS-T洗滌(3×5 min)。(7)觀察成像：待組織標本干后，用緩沖甘油封片。用熒光顯微鏡在紫外光激發(fā)下觀察成像。

2 結果

2.1 胃腺癌組織的形態(tài)學觀察

經(jīng)鏡下形態(tài)學觀察，腫瘤細胞呈乳頭樣、腺樣及實性片狀排列，或(和)單個生長彌漫性分布，根據(jù)癌細胞的異性及分化程度分為高、中、低三個等級。QDs標記后在藍光激發(fā)下，p53出現(xiàn)紅色熒光信號為陽性，出現(xiàn)在細胞核；EGFR出現(xiàn)綠色熒光信號為陽性，出現(xiàn)在細胞膜。

2.2 QDs探針檢測EGFR、p53表達

78例胃癌組織標本參照TNM國際分期標準，根據(jù)腫瘤大小、浸潤情況及淋巴結與遠隔器官轉(zhuǎn)移情況進行分期。其中，T1、T2、T3、T4分別為9例、3例、16例，50例，N0、N1、N2、N3分別為27例、16例、27例，8例；根據(jù)鏡下形態(tài)學組織分化程度分級，高、中、低分化分別為0例、21例、57例。根據(jù)QDs標記后激發(fā)產(chǎn)生熒光情況，對組織標本中表達的強度和密度進行綜合判斷，按照陽性表達的強弱程度分為0、1+、2+和3+四等。QDs標記的78例胃癌組織中，EGFR陽性65例，占83.3%，其中強陽性(3+)41例，占52.6%；p53陽性54例，占69.2%，其中強陽性(3+)44例，占56.4%。結果利用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析(見表1、表2)。

表1 EGFR、p53表達與胃腺癌病理特征的關系

所有因素的EGFR和p53(強)陽性表達經(jīng)卡方檢驗計算P值。其中，兩種因子(強)陽性率均為女性高于男性，特別是EGFR(強)陽性率，女性明顯高于男性。年齡、性別因素中，所有P值均>0.05，即差異無統(tǒng)計學意義。T分期中，EGFR和p53兩種因子陽性率均在T2分期最高，T3分期陽性率最低。所有P值均>0.05，即差異無統(tǒng)計學意義。N分期中，EGFR因子(強)陽性率均在N1分期最高，其次是N3分期，其中強陽性率P=0.038(<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；p53因子陽性率在N2分期最高，P=0.014(<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，強陽性率在N3分期最高，P=0.025(<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。組織分化程度分級中，所有樣本均無高分化，p53強陽性率在低分化中最高，為61.4%，且P=0.024(<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。

表2 EGFR和p53共表達與胃腺癌臨床病理特征的關系

所有因素的EGFR和p53(強)陽性共表達經(jīng)卡方檢驗計算P值。性別因素中，兩種因子強陽性共表達，女性明顯高于男性，且P值<0.05，即差異有統(tǒng)計學意義。年齡因素中，P值>0.05，即差異無統(tǒng)計學意義。T分期中，兩種因子陽性表達均在T2分期最高，所有P值均>0.05，即差異無統(tǒng)計學意義。N分期中，兩種因子(強)陽性表達均在N2分期最高，其中強陽性率P=0.025(<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。組織分化程度分級中，p53(強)陽性表達在低分化中最高，P均>0.05，差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

癌癥的發(fā)生發(fā)展往往不只與單一腫瘤標志物表達有關，對于癌癥的早期診斷來說，單獨檢測某一種腫瘤特異性標志物可能會產(chǎn)生“假陽性”結果。因此，發(fā)展簡單有效的方法對多種腫瘤特異性標志物進行同時檢測，可以為癌癥診斷提供全面而可靠的信息，對于癌癥的早期診斷及預后有非常重要的意義。QDs是一種由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素組成的大小在1-100 nm之間穩(wěn)定的微小晶粒，由于納米材料的尺寸效應和量子限域效應，其具有獨特的熒光性能。在QDs合成過程中，通過控制合成時間、溫度等條件，可制備不同粒徑大小的QDs,基于QDs吸收光譜寬而連續(xù)，發(fā)射光譜狹窄且對稱的光學特性，其在同一光源下受激發(fā)可產(chǎn)生不同顏色的熒光，將多色QDs標記在不同腫瘤標志物分子信標末端，成為多種抗原的QDs熒光探針，經(jīng)與相應抗原特異性結合后，去除未結合的QDs探針，受激發(fā)產(chǎn)生不同顏色熒光信號，即可實現(xiàn)對多種腫瘤標志物的同時定量檢測。實驗用QDs實現(xiàn)了對胃腺癌組織樣本中EGFR和p53的原位標記，得到了清晰的雙色圖像。

p53是重要的腫瘤抑制因子，在細胞周期的調(diào)控、細胞凋亡和腫瘤形成及發(fā)展中具有十分重要的作用。EGFR參與腫瘤細胞的增殖、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡抑制等基因調(diào)控，在多種腫瘤組織中有高表達，在胃癌中的高表達與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及生物學行為密切相關，被認為是胃癌治療的理想靶點，目前已經(jīng)成為胃癌生物治療新的研究熱點。p53和EGFR在胃腺癌中的研究國內(nèi)外鮮有相關報道。本研究利用QDs探針標記成像并對結果統(tǒng)計分析，實驗結果發(fā)現(xiàn)胃腺癌組織標本中的EGFR陽性率占83.3%， p53陽性占69.2%。p53因子陽性表達與淋巴結轉(zhuǎn)移顯著相關(P<0.05)；EGFR與p53因子強陽性表達均與淋巴結轉(zhuǎn)移顯著相關(P<0.05)；所有組織樣本中，未見高分化樣本，p53強陽性表達與分化程度顯著相關(P<0.05)。兩種因子共表達與胃腺癌臨床病理特征的關系的分析中，兩種因子強陽性表達僅與淋巴結轉(zhuǎn)移顯著相關(P<0.05)，與性別、年齡、浸潤程度和分化程度均無關。

隨著QDs探針在多色成像中的進一步應用，對細胞內(nèi)多種特異性標志物的原位成像研究逐漸成為研究熱點[12-15]，以求揭示其在腫瘤侵襲過程中的作用機制。另外，Chunying W等[16]報道了通過QDs標記試條快速同步定量檢測甲胎蛋白和癌胚抗原，為實現(xiàn)多種腫瘤標志物的同步檢測提供了捷徑。QDs技術有助于定量分析p53和EGFR在胃腺癌中的協(xié)同表達，但由于研究報道較少，本組實驗標本數(shù)量有限，有待于后續(xù)大樣本研究進一步驗證p53和EGFR在胃腺癌中的應用價值。

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