細梗香草皂苷對人胰腺癌BxPC-3細胞的體外抑制作用

于賢金 周亮 何亞紅 張筱鳳

以吉西他濱(gemcitabine，GEM) 為基礎的化療藥物主要用于進展期或手術無法切除的胰腺癌的輔助治療[1-3]。但GEM不能明顯提高患者的生存期，且具有較為嚴重的細胞毒性作用[4-5]，因此研發一種新型的高效、低毒抗腫瘤藥物具有重要意義。細梗香草(lysimachia capilliposide hemsl)又名排草、香排草、香草、毛柄珍珠菜, 系報春花科珍珠菜屬植物。細梗香草的主要成分為皂苷(capilliposide，LC)，它有較強的抗腫瘤作用[6-7]。相關體外實驗證實，LC對肺癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌均有生長抑制作用[8-10]，但尚未見其對胰腺癌的作用。本研究觀察LC對人胰腺癌細胞株BxPC-3細胞增殖的影響，初步探究其作用機制。

材料和方法

一、細胞存活率檢測

BxPC-3細胞株由上海長海醫院中心實驗室提供，常規培養傳代。取對數生長期BxPC-3細胞，以5×103個/孔接種于96孔培養板，培養24 h后分別加入2、4、8、16、32、64 μg/ml的LC繼續培養48、72 h，以不加LC的細胞作為對照組，每個濃度每個時間點設6個復孔。LC由浙江大學生物醫學工程學系實驗室提供。培養結束后吸棄原培養液，每孔加100 μl新培養液、20 μl MTT(美國艾美捷科技有限公司)繼續培養1 h，上酶標儀測定各孔在490 nm波長處的吸光值(A490值)。細胞存活率=LC組A490值/對照組A490值×100%，以藥物濃度為橫坐標，繪制細胞存活率曲線，確定LC的50%抑制濃度(IC50)值。

二、細胞凋亡檢測

采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。取對數生長期的BxPC-3細胞，以3×105個/孔接種于6孔板，培養24 h后每孔加入IC50的LC繼續培養48 h，用不含EDTA的胰酶消化、收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次，取(1～5)×105細胞用100 μl Binding Buffer重懸，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶(PI)，輕輕混勻，室溫避光反應10 min。加入400 μl Binding Buffer，混勻，在1 h內上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

三、細胞周期檢測

采用流式細胞儀檢測細胞周期。取對數生長期的BxPC-3細胞，以3×105個/孔接種于6孔板，培養24 h后加入IC50的LC繼續培養24 h，收集細胞，以預冷的75%乙醇固定過夜，PBS緩沖液洗滌2次，棄上清液。分別加入50 μl/ml PI及100 μl/ml RNAase混勻，4℃避光反應30 min，上流式細胞儀檢測細胞周期。

四、凋亡相關蛋白多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)和caspase-3表達檢測

取對照組及IC50的LC培養組培養48 h的細胞，應用裂解液制備細胞勻漿。用BCA法定量蛋白后常規行蛋白質印跡法檢測PARP、caspase-3蛋白表達，以β-actin為內參。兔抗人PARP一抗購自Abcom公司，工作濃度1∶1 000稀釋，羊抗兔caspase-3一抗購自Abcom公司，工作濃度1∶5 000稀釋，最后應用ECL化學發光，X片曝光、顯影、定影。IPP6.0軟件進行條帶掃描，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

五、統計學處理

結 果

一、LC對BxPC-3細胞存活率的影響

8～32 μg/ml LC呈濃度依賴性抑制BxPC-3的存活，但培養48 h與72 h的細胞存活率差異無統計學意義(圖1)。LC干預48、72 h后BxPC-3細胞IC50的LC濃度分別為(15.84±0.7)μg/ml、(15.17±0.76)μg/ml，故選取15 μg/ml的LC進行以下實驗。

圖1 LC對BxPC-3細胞存活率影響的生長曲線

二、LC對BxPC-3細胞凋亡的影響

對照組與15 μg/ml LC干預48 h組BxPC-3凋亡率分別為(1.5±0.22)%、(17.3±0.31)%，差異有統計學意義(t=-71.992,P<0.05，圖2)。

圖2 LC對兩組BxPC-3細胞凋亡的影響

三、LC對BxPC-3細胞周期的影響

對照組與15 μg/ml LC干預24 h組BxPC-3處于G0/G1的比例分別為(44.95±2.59)%、(38.84±2.75)%；G2/M的比例分別為(6.42±1.30)%、(10.78±1.48)%；S期的比例分別為(43.63±3.84)%、(50.38±4.11)%(圖3)，兩組的差異均無統計學意義。

圖3 LC對兩組BxPC-3細胞周期的影響

四、LC對BxPC-3細胞PARP和caspase-3蛋白表達的影響

對照組、15 μg/ml LC干預48 h組的PARP蛋白相對表達量分別為1593.4±29.7、36.1±4.8；caspase-3蛋白相對表達量分別為149.1±10.2、2207.2±92.0(圖4)。LC組的PARP表達顯著下降，而caspase-3表達顯著增加，差異均有統計學意義(t值分別為89.533、-38.505，P值均<0.05)。

圖4 LC對兩組BxPC-3細胞PARP和caspase-3蛋白表達的影響

討 論

我國傳統中醫在腫瘤的治療方面已取得了不少突破。中藥可以直接殺傷腫瘤細胞，聯合中醫藥治療可減輕腫瘤患者癥狀，明顯提高生活質量，延長生存期[11]。此外，中藥與化療伍用還具有較為顯著的增效減毒、逆轉腫瘤細胞耐藥等作用。細梗香草皂苷已在體外實驗中被證實能抑制人鼻咽癌CNE-2細胞惡性表型，并誘導其凋亡；可通過增加細胞內活性氧表達，激活線粒體凋亡途徑，抑制肺癌細胞H460；能顯著抑制前列腺癌、胃癌細胞增殖，其抗腫瘤作用可能與增強免疫功能和抑制腫瘤血管新生有關；還能通過抑制蛋白激酶活性，降低人非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的耐藥性[8-10,12]。

細胞凋亡是指機體細胞在發育過程中或在某些因素作用下,通過細胞內基因及其產物的調控而發生的一種程序性細胞死亡，可維持機體內環境穩定。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)家族在細胞凋亡中起著重要作用。其中caspase-3是多種凋亡途徑的共同下游效應部分，是細胞凋亡過程中最主要的執行者，能特異性識別、分解PARP，阻止其修復細胞受損DNA；還能裂解核纖層蛋白、凝溶膠蛋白和激動蛋白等，破壞細胞完整性，最終導致細胞凋亡[13]。本研究結果顯示LC對BxPC-3細胞呈濃度依賴性顯著抑制細胞的存活率，LC干預BxPC-3細胞48 h后，細胞凋亡顯著增加，caspase-3表達上調，PARP蛋白表達下調，提示LC抑制BxPC-3生長的作用機制可能是通過激活caspase-3，分解PARP，抑制受損細胞的基因修復，誘導胰腺癌細胞凋亡。

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