幾丁質酶對香菇多糖提取的影響

李俊峰，張揚揚，李 明

（通化師范學院食品科學與工程學院，吉林通化 134001）

香菇為擔子菌亞門，擔子菌綱，傘菌目，側耳科。香菇屬真菌，因其口味鮮美、香味濃郁、營養豐富，有顯著的藥用及滋補作用而被譽為“蘑菇皇后”“抗癌新兵”“菌中之秀”[1]。香菇多糖是從香菇中分離出的一種高純度、高分子結構的葡聚糖[2]，在免疫調節[3]、抗腫瘤[4]、抗病毒和抗感染等方面有很強的活性，其療效高、毒副作用小，具有很高的研究和開發價值。因此，香菇多糖被廣泛應用于食品工業、發酵工業、醫療保健等領域[5-6]。目前，多糖的提取方法主要有熱水浸提法、超聲波提取法、稀酸稀堿浸提法、微波提取法、酶解法等幾種方法[7]。傳統的浸提法時間長、得率低、能耗大，為克服傳統提取方法的缺點，許多學者研究了亞臨界水提取法[8]，超臨界二氧化碳萃取技術與熱水浸提法[9-10]，超濾膜技術提取法[11]、纖維素酶協同超聲波法[12]、響應面法優化熱水浸提法[13]等。

研究顯示，在香菇等真菌類食品原料中，活性多糖主要存在于由纖維素和幾丁質構成的細胞壁中[14]。為了提取活性多糖，首先必須破壞纖維素和幾丁質在細胞壁中構成的網絡結構，從而將活性多糖釋放出來，才能充分并有效地提取活性多糖。但是，在現有的酶法提取香菇多糖的試驗中，主要研究纖維素酶、果膠酶和蛋白酶對香菇多糖提取的影響，而幾丁質酶在香菇多糖的提取研究中還沒有報道，而幾丁質酶的存在可能會阻礙一部分活性多糖的釋放，導致活性多糖不能被充分提取。

試驗首次采用幾丁質酶輔助提取香菇多糖，并與纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶進行對比，從而考查幾丁質酶對酶法提取香菇多糖得率的影響。研究結果對補充香菇多糖提取的研究內容、促進香菇多糖的開發與應用具一定的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

干香菇（市售）；苯酚、濃硫酸、無水乙醇、葡萄糖等試劑均為分析純；幾丁質酶（活力≥200 U/g）、纖維素酶（活力≥400 U/mg）、果膠酶（活力≥50 U/g）、木瓜蛋白酶（活力≥800 U/mg），上海一基實業有限公司提供。

1.2 儀器與設備

FW-200型高速萬能粉碎機，北京中興偉業儀器有限公司產品；SY200型振動篩，新鄉市特昌振動機械有限公司產品；TDL-40B型離心機，上海安婷科學儀器廠產品；RE-2000型旋轉蒸發儀，鄭州市煜城儀器有限公司產品；722S型可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 香菇多糖的提取

（1）工藝流程。粉碎→過篩→稱量→提取→抽濾→旋轉蒸發→醇沉→離心→多糖。

（2） 香菇多糖的提取。將干香菇粉碎過80目篩，稱取一定量香菇干粉，回流提取，將提取液進行抽濾，濃縮至1/3左右，用4倍體積的95%乙醇浸提12 h，離心后得到香菇多糖。1.3.2 熱水浸提法單因素試驗

（1）不同料液比對香菇多糖得率的影響。固定提取溫度55℃，提取時間2 h，物料粒度80目，考查料液比為 1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35時，對香菇多糖得率的影響。

（2）不同提取溫度對香菇多糖得率的影響。固定料液比1∶25，提取時間2 h，物料粒度80目，考查溫度為55，75，85，95，105℃時，對香菇多糖得率的影響。

（3）不同提取時間對香菇多糖得率的影響。固定料液比1∶25，提取溫度55℃，物料粒度80目，考查提取時間為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h時，對香菇多糖得率的影響。

（4）不同物料粒度對香菇多糖得率的影響。固定料液比1∶25，提取溫度55℃，提取時間2 h，考查物料粒度為40，60，80，100，120目時，對香菇多糖得率的影響。

1.3.3 正交試驗設計

選取料液比、提取時間、提取溫度、原料粒度4個因素，進行四因素三水平正交試驗，每組試驗做3次平行。基于單因素試驗結果，選擇料液比分別為1∶25，1∶30，1∶35；提取時間分別為 1.5，2.0，2.5 h；粒度60，80，100目；提取溫度分別為75，85，105℃進行正交試驗。

正交試驗設計見表1。

1.3.4 酶法輔助提取香菇多糖

將干香菇粉碎過80目篩，稱取5.00 g香菇干粉，加入125 mL蒸餾水中，加入酶制劑，在一定條件下酶解，酶解后于85℃條件下提取2 h，將提取液進行抽濾，在濃縮至1/3左右，用4倍體積的95%乙醇浸提12 h，離心后得到香菇多糖。

表1 正交試驗設計

1.3.5 檢測方法

利用苯酚硫酸法[15]測定提取物中多糖含量，先制作葡萄糖標準曲線，然后在相同條件下測定樣品吸光度，通過代入標準曲線換算出樣品得率。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的制作

以葡萄糖質量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線如圖1所示。標準曲線方程為Y=1.528 9X+0.054 4，R2=0.979 6。

葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 不同料液比對香菇多糖得率的影響

不同料液比對香菇多糖得率的影響見圖2。

圖2 不同料液比對香菇多糖得率的影響

由圖2可知，提取過程中，料液比為1∶15～1∶25時，香菇多糖得率逐漸增高，可能是因為隨著液料比的增加，提高了多糖從物料顆粒內部向溶劑擴散的傳質效率，從而使多糖得率不斷上升。當料液比在1∶25～1∶35時，得率的上升具有漸漸放緩的趨勢。根據試驗所得結果，同時考慮提取成本，選擇為1∶25為最佳提取料液比。

2.2.2 不同提取溫度對香菇多糖得率的影響

不同提取溫度對香菇多糖得率的影響見圖3。

圖3 不同提取溫度對香菇多糖得率的影響

由圖3可知，當提取溫度為55～105℃時香菇多糖得率逐漸增高，之后放緩。當提取溫度為105℃時達到最大值。這可能是由于溫度的上升提高了多糖在水中的溶解度，從而提高了多糖的得率。但是，當提取溫度高于85℃時，多糖得率的上升并不顯著。因此，為了不增加提取過程的能耗，確定提取溫度為85℃。

2.2.3 不同提取時間對香菇多糖得率的影響

不同提取時間對香菇多糖得率的影響見圖4。

由圖4可知，當提取時間在1～2 h時，隨提取時間的增加，香菇多糖得率也隨之增高。當提取時間為2 h時，香菇得率最高。當提取時間在2～3 h時，隨提取時間的增加，香菇多糖得率降低。這可能是因為提取時間過長，香菇中的其他水溶性成分溶出增加，抑制了香菇多糖的溶出。因此，根據試驗結果確定提取時間為2 h。

2.2.4 不同物料粒度對香菇多糖得率的影響

不同物料粒度對香菇多糖得率的影響見圖5。

由圖5可知，粒度為40～80目時，香菇多糖得率隨物料粒度的增加而上升，當物料粒度為80目時，香菇多糖得率最高。當物料粒度在80～100目時，隨物料粒度的增加，香菇多糖得率不斷降低。這可能是因為粒度過低，在粉碎過程中破壞了香菇多糖的結構，導致多糖得率降低。因此，根據試驗結果確定物料粒度為80目。

2.3 正交試驗結果與分析

根據正交試驗設計表，選取料液比、提取時間、提取溫度、原料粒度4個因素，進行四因素三水平正交試驗。

正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果

由表2可知，對香菇多糖得率影響因素由大到小為提取時間＞料液比＞物料粒度＞提取溫度。水平2的香菇得率最高，試驗結果最好，試驗水平組合為A1B2C2D2，而由K值可知，試驗最佳組合為A3B2C2D2。驗證試驗結果為1.678%，得率高于A1B3C2D2。由正交試驗可得，香菇多糖最佳提取工藝參數為料液比1∶35，提取溫度105℃，提取時間2 h，物料粒度80目，香菇多糖得率為1.678%。

2.4 酶對香菇多糖得率的影響

為了得出幾丁質酶對香菇多糖的影響，試驗中將幾丁質酶與木瓜蛋白酶、果膠酶、纖維素酶的酶法輔助提取結果進行了比較。

不同酶法輔助提取香菇多糖的結果見表3。

表3 不同酶法輔助提取香菇多糖的結果

通過查閱酶法提取香菇多糖的研究文獻，歸納得出木瓜蛋白酶、果膠酶和纖維素酶的最佳酶解條件為酶解溫度40℃左右，酶解pH值5左右，酶使用量0.5%左右。因此，為了將不同酶的提取結果進行比較，試驗中將4種酶的酶解條件保持一致。

由表3可知，酶法輔助提取香菇多糖的得率都高于水提法，且幾丁質酶輔助提取法的得率最高。這一結論說明，為了充分提取存在于香菇細胞壁中的活性多糖，必須破壞纖維素和幾丁質在細胞壁中構成的網絡結構，僅破壞纖維素、蛋白質和果膠還不足以充分提高多糖的得率。因此，研究結果證明，幾丁質酶在提高香菇多糖的得率方面具有顯著作用。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗，考查了不同料液比、提取溫度、原料粒度和提取時間對香菇得率的影響，從而得出熱水提香菇多糖最佳提取工藝參數為料液比1∶35，提取溫度105℃，提取時間2 h，物料粒度80目，香菇多糖得率為1.678%。酶法提取試驗得出，木瓜蛋白酶提取香菇多糖得率為1.916%，果膠酶提取香菇多糖得率1.926%，纖維素酶提取香菇多糖得率1.684%，幾丁質酶提取香菇多糖得率2.05%。研究結果可以證明，幾丁質酶對香菇多糖的提取具有顯著的影響。

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