苜蓿葉蛋白ACE抑制肽的制備

馬洪鑫，余 瓊，李明生，高丹丹，陳士恩

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730030）

0 引言

目前，高血壓已成為危害國民身體健康的頭號殺手，也是引起腦血管病、心臟病、腎臟病發(fā)生和死亡的最主要因素。由高血壓造成的相關(guān)并發(fā)癥給社會和家庭造成了巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。高血壓是一種人類最常見的慢性病，治療和預(yù)防高血壓是目前人們最為關(guān)注的醫(yī)學(xué)課題。

高血壓是持續(xù)血壓過高的疾病，是一種以動脈壓升高為特征的疾病，主要原因是體內(nèi)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE） 的調(diào)節(jié)作用[1]。ACE既是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，也是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，對高血壓有著至關(guān)重要的調(diào)控作用。ACE抑制劑是治療高血壓病的有效藥物，但臨床所用的ACE抑制劑大多為化學(xué)合成劑，會產(chǎn)生許多不良反應(yīng)，如咳嗽、味覺功能紊亂、皮疹等。因此，人們越來越傾向于尋找天然來源的ACE抑制劑。苜蓿是一種粗蛋白質(zhì)含量高、營養(yǎng)豐富的豆科牧草，其葉片蛋白含量很高。苜蓿葉蛋白是一種具有高開發(fā)價值的新型蛋白質(zhì)產(chǎn)品，苜蓿葉蛋白經(jīng)酶解提取后，可制備出具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE） 活性物質(zhì)。目前，國內(nèi)外對苜蓿葉蛋白的研究與開發(fā)主要集中于提取工藝和營養(yǎng)功效上，而有關(guān)其蛋白質(zhì)的功能機理及其酶解后的蛋白肽研究甚少，特別是ACE抑制肽的生物活性研究更是鮮見報道。試驗以苜蓿葉為原料提取苜蓿葉蛋白，并利用不同蛋白酶對其進行酶解，以制備出具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）活性物質(zhì)[2]，并以酶解溫度、酶解pH值、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，選出最佳酶解條件，為苜蓿的開發(fā)和利用提供新的途經(jīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花苜蓿（品種為阿爾岡金），種植于西北民族大學(xué)校園內(nèi)的紫花苜蓿；胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、馬脲酰-組氨酰-亮氨酸（HHL）、乙酸乙酯，1 mol/L氫氧化鈉、1mol/L鹽酸、ACE。

1.2 主要設(shè)備

ISO 9001型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司產(chǎn)品；JJ-2型組織搗碎勻漿機，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；H2050R型臺式高速冷凍離心機，湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品；LGJ-10型真空冷凍干燥機，北京松原華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；數(shù)控定時超聲波清洗機，上海聲彥超聲波儀器有限公司產(chǎn)品；微電腦便攜式酸度計；UV-1800型紫外分光光度計，深圳市怡華新電子有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的采集及預(yù)處理

苜蓿的最佳收割期為初花期，以2～3茬的苜蓿為試驗材料，收割后的苜蓿應(yīng)在陰涼處存放，存放時間最好不要超過3 d，將收割的苜蓿清洗去除雜物，然后去桿取葉，便于打漿。

1.3.2 苜蓿葉蛋白的提取

稱取一定量的苜蓿葉，按適當(dāng)?shù)牧弦罕扔媒M織搗碎機，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min打漿5 min，然后用紗布過濾汁液，再用濾紙過濾，得到含有苜蓿葉蛋白的苜蓿綠色草汁。采用2次水浴加熱的方法，將含有苜蓿葉蛋白的苜蓿綠色草汁加熱到50℃，然后在恒溫水浴鍋內(nèi)恒溫1 h。冷卻后裝入離心管中，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心25 min，取上清液。再次采用水浴加熱的方法將第1次加熱冷卻離心后的上清液加熱到85℃，然后在恒溫水浴鍋內(nèi)恒溫7 min。冷卻后裝入離心管，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心25 min，即得到苜蓿葉蛋白濃縮物[3-4]。采用真空冷凍裝置干燥，即得到干燥的苜蓿蛋白粉。

1.3.3 酶解苜蓿葉蛋白粉制備ACE抑制肽

取適量苜蓿葉蛋白粉用蒸餾水將其溶解為一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的酶解底物，在90℃恒溫水浴鍋中預(yù)處理10 min，冷卻至設(shè)定溫度后，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至最適范圍內(nèi)，酶用量為底物質(zhì)量的3.5%，酶解過程中用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)節(jié)維持pH值在各種酶最適pH值±0.05之間。酶解結(jié)束后在沸水浴中滅酶10 min，迅速冷卻，并在4℃，10 000 r/min條件下離心20 min，取上清液測定ACE抑制率[5]，將上清液冷凍干燥即得苜蓿ACE抑制肽。

不同蛋白酶用量及反應(yīng)條件見表1。

表1 不同蛋白酶用量及反應(yīng)條件

（1） 酶解溫度對苜蓿葉蛋白提取的影響。以ACE抑制率為指標(biāo)，設(shè)45，50，55，60，65℃5個處理水平進行試驗，按1.3.3操作考查酶解溫度對苜蓿葉蛋白提取的影響。

（2） 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對苜蓿葉蛋白提取的影響。以ACE抑制率為指標(biāo)，設(shè)定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，3%，4%，5%，6%5個處理水平進行試驗，按1.3.3操作考查底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對苜蓿葉蛋白提取的影響。

（3）酶解pH值對苜蓿酶葉蛋白提取的影響。以ACE抑制率為指標(biāo)，以pH值6.5～8.5作為沉降苜蓿葉蛋白的最佳范圍。以1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值，設(shè)定pH值6.5，7.0，7.5，8.0，8.5共5個處理水平進行試驗，考查pH值對苜蓿葉蛋白提取的影響，方法同上。

1.3.4 ACE抑制肽的抑制率測定

ACE在37℃，pH值8.3的條件下催化分解血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的底物Hip-His-Leu（HHL）產(chǎn)生馬尿酸，該物質(zhì)在波長228 nm處具有特征吸收峰。當(dāng)加入ACE抑制劑時，ACE對HHL的催化分解作用受到抑制，馬尿酸的生成量減少。通過測定加入抑制劑前后生成馬尿酸紫外吸收的大小差別，即可計算出抑制率的大小[6-9]。

吸取 80 μL 酶解物加入 200 μL，5 mmol HHL（含有200 mmol/L NaCl硼酸緩沖液，pH值8.3） 中，于37℃條件下水浴預(yù)熱5 min。立即加入20 μL ACE（0.002 U/mL） 啟動反應(yīng)，恒溫保持30 min后，加入0.25 mL濃度為1 mol/L的HCl終止反應(yīng)，然后取1.5 mL乙酸乙酯加入各管，均勻混合15 s，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min后，取出1.0 mL酯層轉(zhuǎn)入另一試管，在95℃的烘箱中經(jīng)30 min烘干，再重新溶于3.0 mL去離子水中，測定OD228處光密度[10]。

酶活單位定義：1單位酶活定義為在37℃，1 min內(nèi)催化HHL形成1 mol馬尿酸的酶用量。活性抑制率按下式計算：

式中：A——ACE及ACE抑制肽都加入的條件下測得的吸光度；

B——不加ACE抑制肽條件下測定的吸光度；

C——不加ACE條件下測得的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶酶解物的ACE抑制率不同蛋白酶酶解物的ACE抑制率見圖1。

圖1 不同蛋白酶酶解物的ACE抑制率

采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶6種商品蛋白酶酶解苜蓿蛋白，對其4 h酶解物的ACE抑制率進行測定。從圖1可知，不同蛋白酶的酶解物的ACE抑制率是有一定差異的，蛋白酶的選擇在生產(chǎn)生物活性肽的過程中十分重要。其中，木瓜蛋白酶水解物的ACE抑制效果最好，抑制率達到90.69%±2.77%，其他蛋白酶水解物也有一定的ACE抑制活性，抑制率如下：風(fēng)味蛋白酶55.36%±0.98%，堿性蛋白酶54.39%±2.38%，胰蛋白酶48.01%±1.07%，中性蛋白酶41.74%±1.22%，胃蛋白酶39.28%±1.87%。因此，選擇木瓜蛋白酶酶解苜蓿蛋白制備ACE抑制肽。

2.2 酶解單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶解溫度對ACE抑制率的影響

酶解溫度對ACE抑制率的影響見圖2。

圖2 酶解溫度對ACE抑制率的影響

在酶解溫度分別為45，50，55，60，65℃，酶解時間為4 h時，酶解溫度對ACE抑制率如圖2所示。當(dāng)酶解溫度從45℃升高到55℃，ACE抑制率逐漸升高；當(dāng)酶解溫度繼續(xù)升高時則ACE抑制率呈逐漸下降趨勢。這表明一定范圍內(nèi)酶解溫度上升有利于酶促反應(yīng)的進行，但酶解溫度過高，會導(dǎo)致蛋白酶變性，從而使酶活性減弱。當(dāng)酶解溫度為55℃時，ACE抑制率最高（83.26%±0.61%），因此確定最佳酶解溫度為55℃。

2.2.2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對ACE抑制率的影響

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對ACE抑制率的影響見圖3。

圖3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對ACE抑制率的影響

觀察了不同酶用量與底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2%，3%，4%，5%，6%；酶解溫度50℃，酶解pH值7.5，酶解時間4 h時進行酶解。從圖3可看出，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)從2%增加到4%時，酶解物的ACE抑制率明顯增加（68.85%±0.04%～81.18%±0.04%）；而當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)持續(xù)增加到6%時，酶解物的ACE抑制率反而有所下降（51.03%±0.07%）。由此可見，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%（抑制率81.18%±0.04%） 最為適宜。

2.2.3 酶解pH值對ACE抑制率的影響

酶解pH值對ACE抑制率的影響見圖4。

圖4 酶解pH值對ACE抑制率的影響

木瓜蛋白酶的作用pH值范圍較廣，所以酶解pH值從6.5～8.5的梯度進行分析。從圖4可看出，木瓜蛋白酶在不同pH值條件下酶解苜蓿蛋白，其酶解產(chǎn)物的ACE抑制率有顯著差異。在酶解pH值從6.5～7.5時，酶解物的ACE抑制率逐漸增加；當(dāng)酶解pH值為7.5時，ACE抑制率達到最大（64.87%±0.49%）。當(dāng)酶解pH值繼續(xù)增加時，ACE抑制率隨著酶解pH值的增加而下降。由此可見，木瓜蛋白酶酶解苜蓿蛋白酶的最適pH值為7.5。

3 結(jié)論

苜蓿葉蛋白來源廣泛、營養(yǎng)豐富，不含動物性膽固醇，蛋白質(zhì)中氨基酸含量豐富，是一種營養(yǎng)價值豐富且能降血脂的保健食品成分。試驗?zāi)康氖呛Y選酶解制備ACE抑制肽的最佳用酶，根據(jù)試驗結(jié)果可知，在這6種商品蛋白酶中，木瓜蛋白酶抑制率為90.69%±2.77%，是酶解苜蓿蛋白制備ACE抑制肽的最佳用酶，其最佳酶解反應(yīng)條件為酶解pH值7.5，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，酶解時間4 h。試驗僅是對苜蓿葉蛋白ACE抑制肽酶解用酶的初步篩選，試驗中各酶解用酶均在其最適酶解溫度和酶解pH值條件下進行酶解反應(yīng)。試驗未進行單因素優(yōu)化試驗，因此無法獲得更精確的影響結(jié)果，這些問題將在接下來的研究中完成。

參考文獻：

[1]張焱.大豆蛋白ACE抑制肽的酶法制備及分離純化 [D].合肥：合肥工業(yè)大學(xué)，2007.

[2]賀玉薇，王松柏，許俊，等.苜蓿天然成分的營養(yǎng)保健功能及其開發(fā)前景 [G]//第二屆中國苜蓿發(fā)展大會暨牧草種子、機械、產(chǎn)品展示會.北京：中國草學(xué)會，2003.

[3]劉青廣.苜蓿葉蛋白的提取及深加工技術(shù)的研究 [D].石河子：石河子大學(xué)，2005.

[4]王峰.紫花苜蓿葉蛋白四種提取工藝比較研究 [D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2005.

[5]陳飛平.莧籽ACE抑制的分離純化及其性質(zhì)評價 [D].重慶：西南大學(xué)，2013.

[6]高丹丹.棉籽抗氧化多肽和ACE抑制多肽的研究 [D].南昌：南昌大學(xué)，2010.

[7]Cushman D W，Cheung H S.Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung.[J].Biochemical Pharmacology，1971，20 （7）：1 637-1 642.

[8]Chang B W，Chen R L，Huang I J，et al.Assays for angiotensin converting enzyme inhibitory activity.[J].Analytical Biochemistry，2001（1）：84-88.

[9]Shihabi Z K.Analysis of angiotension-converting enzyme by capillary electrophoresis.[J].Journal of Chromatography，1999（5）：185-188.

[10]姚成虎，王志耕，梅林，等.胃蛋白酶水解珠蛋白獲得ACE抑制肽的工藝優(yōu)化 [J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2008，24（5）：284-288.◇