可溶可逆聚合物Eudragit S-100對豬胰脂肪酶的固定化

袁久剛， 申 璇，　張慶娟， 余圓圓，　王 平， 王 強，　范雪榮

（1.江南大學 生態紡織教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.山東如意集團，山東 濟寧 272000）

脂肪酶能在油水界面上催化酯水解、酯交換以及酯合成等反應，廣泛應用于食品、醫藥、紡織以及日化等工業中[1-2]。然而受脂肪酶蛋白天然性質的局限，這種催化劑在很多情況下不能滿足催化反應的要求；另外，昂貴的價格、較低的回收利用性和催化穩定性又使其在工業上的應用受到極大限制。

固定化是脂肪酶改性常用的方法之一，通過固定化修飾，脂肪酶分子穩定性得到大幅度提高，而且固定化脂肪酶極易與反應物和產物分離，這使得反應過程的可控性以及酶的重復利用性都得到提高，有助于降低成本[3-4]。目前，固定化常用的載體主要有吸附用的多孔性載體如大孔樹脂[5]、有機硅藻土[6]，包埋采用的海藻膠、卡拉膠等[7]，此外還有共價交聯采用的各種有機大分子載體如多糖類物質等[8]。

這些載體及其固定化方法各有優點，但是大部分固定化脂肪酶都是采用水不溶性載體，這導致催化反應過程中底物與酶的接觸以及產物的擴散都被限制，而對于可溶性大分子底物以及一些高分子聚合物的催化反應，如動物纖維脫脂，紡織品去污、廢棄滌綸的降解等，這種不溶性載體就會大大限制脂肪酶的催化效率。因此，若能尋找一種智能型的固定化載體，使其在催化反應時處于溶解狀態，而在反應結束時又可以通過改變某種條件使其不溶，便可以很好地解決這一問題。

Eudragit S-100便是這樣一種智能型的可溶可逆高分子聚合物。它主要由甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯共聚而成，其突出的優點是溶解性可通過改變pH調節，在pH值高于5.5時溶解，pH值低于4.5時沉淀[9-10]。這種溶解-沉淀可逆特性使其在應用于生物酶固定化時可表現出獨特的優勢，即：固定化改性酶可在溶解狀態下催化不溶性底物反應，而反應結束后，固定化酶又可以轉變為不溶狀態進行回收。而且，EudragitS-100還具有無毒、相對價廉、與酶親和性等優點。因此，將其作為酶的固定化材料具有得天獨厚的優勢。

以Eudragit系列樹脂為載體來制備固定化酶，可以通過吸附、包埋和共價結合的方法對酶進行固定化。本文作者試圖利用共價結合的方法采用該樹脂對脂肪酶進行固定化修飾。該研究有益于改善傳統固定化脂肪酶存在的異相催化效率低以及回收困難的特點。

1　材料與方法

1.1　試劑與儀器

豬胰脂肪酶 （100-500 units/mg protein（using olive oil （30 min incubation），Sigma 公 司 產 品 ；Eudragit S-100，阿拉丁試劑有限公司產品；EDC，阿拉丁試劑有限公司產品；其他化學試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司，分析純級別。

Rapid恒溫振蕩水浴鍋，廈門瑞比公司產品；UV-1800紫外可見分光光度儀，日本島津企業管理（中國）有限公司產品；F-4600熒光分光光度儀，日本Hitachi產品；FA25高速攪拌器，上海弗魯克流體機械制造有限公司產品。

1.2　實驗方法

1.2.1蛋白質含量的測定根據文獻[11]，采用考馬斯亮藍G-250（Bradford法）測定蛋白質含量。

1.2.2脂肪酶酶活測定按照江慧芳等人[12]的研究方法，以橄欖油聚乙烯醇乳化液作為底物，采用銅皂法進行測定，其相對酶活定義為：

式（1）中，ER為相對酶活，E 為所測酶活值，Em為該組所測最大酶活值。

1.2.3Eudragit溶液配制將5 g Eudragit S-100粉末加入到70 mL蒸餾水中，用3 mol/L NaOH溶液調pH 11，完全溶解后，用3 mol/L HCl溶液調pH 7.2，然后加蒸餾水定容至100 mL，得到5 g/dL的Eudragit S-100溶液。

1.2.4脂肪酶的固定化取一定量配制好的Eudragit S-100溶液，用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液將其稀釋到 2%（W/V），加入 EDC（0.2 g/dL），在 30 ℃下磁力攪拌1 h，使Eudragit S-100分子上的羧基充分活化，然后向溶液中逐滴加入酶液，于恒溫振蕩器反應 6 h（200 r/min），反應結束后，用 0.5 mol/L 乙醇銨溶液滴定至pH=8，終止固定化修飾。最后用pH 7的Tris-鹽酸緩沖液（0.1 mol/L）定容至50 mL，得到溶解狀態下的Eudragit S-100共價修飾脂肪酶，于4℃下儲存備用。

1.2.5平均氨基修飾率測定采用TNBS分光光度法進行測試[13]。取2份各1 mL TNBS溶液，分別加入1.5 mL未修飾酶和固定化酶溶液，在室溫條件下靜置30 min，然后測定溶液在420 nm條件下的吸光度值。平均氨基修飾率按以下公式（2）計算：

式（2）中，X為平均氨基修飾率，A為修飾后蛋白質溶液的吸光度值，A0為修飾前蛋白質溶液的吸光度值。

1.2.6熒光光譜檢測采用F-4600熒光分光光度計，設定激發波長為280 nm，狹縫寬度為5 nm，掃描速度為12 000 nm/min，電壓400 V，響應時間為0.1 s。測定脂肪酶在280～550 nm內的發射光譜。

1.2.7修飾酶可逆可溶性測試修飾劑Eudragit S-100和其固定化修飾酶的溶解性會隨著溶液pH的改變而發生變化，具有可逆可溶性。參照Dourado等人[14]的方法，以溶液在470 nm下的吸光度值來表征修飾劑和修飾酶的溶解性。以溶質完全不溶解時溶液的吸光度值為100%，溶質完全溶解時溶液的吸光度值為0%。

1.2.8重復使用性能取一定量的修飾酶，邊攪拌邊滴加醋酸溶液，調節溶液的pH至4.0，靜置30 min后離心，保留沉淀，沉淀用pH為4.0的緩沖溶液沖洗3次，洗滌后的沉淀溶解于pH為7.5的緩沖溶液，并定容至初始體積，然后測試該酶液的活力。重復該操作5次，視為重復使用修飾酶5次，以酶液的初始酶活為100%，計算每次使用時修飾酶的相對酶活。

2　結果與討論

2.1　Eudragit S-100對脂肪酶的平均氨基修飾率

蛋白質中的游離氨基可以與還原糖的醛基末端發生羰胺縮合反應，從而使游離態的氨基成為結合態，因此，采用TNBS法可以測得脂肪酶經過Eudragit S-100固定化修飾后的平均氨基修飾率。對不同固定化時間下的修飾脂肪酶進行TNBS分光光度法測定，結果如圖1所示。

圖1　不同反應時間對氨基修飾率的影響（反應溫度15℃）Fig.1　Effect of reaction time on modification rate of free amino（reaction temperature 15 ℃）

從圖1可以明顯看出，脂肪酶中的氨基確實與Eudragit S-100樹脂中的羧基進行了反應，實現了在Eudragit S-100上的固定化。另外，從圖中也可以看出：當時間較短時，Eudragit S-100不能對豬胰脂肪酶進行有效的固定化修飾，因此其氨基修飾率較低。隨著固定化時間的延長，脂肪酶的平均氨基修飾率也逐漸提升，當反應進行6 h后，Eudragit S-100固定化脂肪酶的平均氨基修飾率達到52.4%，再延長反應時間，其氨基修飾率并未有較大幅度提升。這主要是由于蛋白質的空間位阻以及Eudragit S-100本身含有的活化羧基數目有限，使得脂肪酶中能夠參與修飾的游離氨基已經全部參與反應，因此，其平均氨基修飾率不再發生變化。

2.2　固定化修飾對脂肪酶構象的影響

在天然蛋白質分子結構中，酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）和苯丙氨酸（Phe）在280 nm的激發波長下會發射熒光，而固定化修飾劑Eudragit S-100則沒有熒光特性，因此根據溶液的熒光光譜特征，可以分析蛋白結構的變化[15]。對不同時間固定化修飾后的脂肪酶進行熒光光譜檢測，結果如圖2所示。

從圖2中可以看出，在280 nm的激發波長下，原酶的最大發射波長為343 nm，一般認為該內源熒光來源于色氨酸殘基。經過固定化的脂肪酶則在345～346 nm處有熒光吸收，其強度也發生了變化，通常認為這是由于固定化修飾導致脂肪酶構象發生變化所致。熒光發射光譜紅移，說明原來位于酶分子內部的色氨酸殘基向酶分子表面發生了遷移[16]；而峰強度呈現先增大后下降的趨勢，說明在修飾過程中，隨著反應時間的延長，脂肪酶的蛋白結構由α-螺旋向β-折疊轉變，最初蛋白結構被拉伸、展開，使得色氨酸殘基暴露數量先增加，峰強度變大，而后隨著正確折疊，蛋白質分子結構變得緊湊，氨基酸暴露數量也減少，最終導致熒光強度降低[17]。但是，折疊程度過大不利于脂肪酶酶活的表達，因此，結合圖1中的氨基修飾率可以看出，固定化修飾時間不易過長。

圖2　不同反應時間下原酶與固定化脂肪酶的熒光光譜Fig.2　Fluorescence　spectra　of　native　lipase　and immobilized lipase after different reaction time

2.3　固定化修飾對脂肪酶最適溫度的影響

溫度對酶的催化反應影響極大，只有在最適溫度下，酶的催化活力才能得到最大程度的發揮。對不同溫度下游離脂肪酶和固定化修飾脂肪酶的酶活力進行測定，結果如圖3所示。

圖3　固定化修飾對脂肪酶最適溫度的影響Fig.3　Effectofimmobilization　on　the　optimum temperature of lipase

從圖3可以發現，Eudragit S-100固定化修飾前后脂肪酶的最適溫度均為40℃左右，固定化修飾對脂肪酶的最適溫度并沒有造成很大影響。但是從實際的絕對酶活力也可以看出，除了降低脂肪酶在最適溫度條件下的酶活外，固定化脂肪酶在其它溫度條件下都較游離脂肪酶有更高的絕對酶活力，尤其是在較低反應溫度條件下，固定化修飾后的脂肪酶比游離脂肪酶有更高的水解活力。造成這種現象的原因可能是：固定化修飾后，脂肪酶與Eudragit S-100載體進行了多點共價連接，可以有效防止酶分子伸展變形，提高了脂肪酶對外界溫度變化的適應性。

2.4　固定化修飾對脂肪酶最適pH的影響

對不同pH下游離脂肪酶和Eudragit S-100固定化脂肪酶的酶活分別進行測試，結果如圖4所示。

圖4　固定化修飾對脂肪酶最適pH的影響Fig.4　Effect of immobilization on the optimum pH of lipase

從圖4可以發現，無論是游離脂肪酶還是固定化脂肪酶，隨著pH的逐漸增加，酶活均呈現先增大后降低的趨勢。在酸性條件下游離脂肪酶的酶活較低，而在堿性條件下酶活迅速增大并在pH為7.5～8.0時酶活達到最大值，這與豬胰脂肪酶的堿性水解特性非常相符。固定化后脂肪酶的最適反應pH也在7.5～8.0之間，相比于游離脂肪酶，其最適pH值向堿性方向略有移動，這主要是由于Eudragit S-100樹脂本身為陰離子性物質，因此與其結合后，脂肪酶的微環境發生了變化，導致其最適pH值發生了變化[18-19]。

2.5　固定化脂肪酶的可溶可逆性

Eudragit S-100本身具有pH響應的可逆可溶性，但是當Eudragit作為載體與脂肪酶共價連接后，形成的固定化修飾酶能否保留Eudragit的可逆可溶性，其響應pH范圍會否發生改變，對于脂肪酶的催化以及回收都有重要影響。本文參照Yu Yuanyuan等人[20]的方法對Eudragit S-100固定化脂肪酶的可逆可溶性進行了研究，結果如圖5所示。

圖5　固定化脂肪酶的可溶可逆性Fig.5　Reversible solubility of immobilized lipase

從圖5中可以看出，當溶液pH大于5.5時，Eudragit S-100和固定化修飾酶溶液在470 nm處的吸光度均為0%，說明此時修飾劑與固定化脂肪酶均能完全溶解；而當溶液pH低于4時，所有溶液的吸光度值達到最大值，此時修飾劑與修飾酶均已完全沉淀。另外，從圖中可以看出，Eudragit S-100與酶共價交聯后，其溶解度的pH變化范圍向pH大的方向發生了移動。這是因為Eudragit S-100自身是酸性的，當其與酶發生共價連接后，結構中的自由羧基數目減少，從而導致溶解度的pH變化范圍向pH大的方向移動。總體來看，脂肪酶與Eudragit S-100進行固定化修飾后，樹脂的可溶可逆性沒有被破壞，而且其pH響應范圍也介于脂肪酶最適pH以下，對于脂肪酶的催化水解以及回收都不會造成太大影響。

2.6　固定化脂肪酶的可重復使用性

將固定化修飾酶溶液的pH調節至4.0，修飾酶會沉淀析出。利用該性質，可以回收使用固定化酶。對不同次數回收后的固定化脂肪酶活力進行測試，結果如圖6所示。Fig.6Reuse of immobilized lipase

圖6　固定化脂肪酶的可重復使用性

從圖6可以看出，Eudragit S-100固定化修飾脂肪酶在一次使用后，其脂肪酶酶活力的保留率約為92%，經過5次重復使用后，脂肪酶酶活力的保留率仍為45%，表現出較好的重復使用性能。在重復使用過程中出現酶活損失的主要原因如下：首先，酶在每次回收過程中無法確保100%回收，沉淀以及沖洗過程會損失一部分酶；其次，在回收過程中，反復調節溶液的pH值改變酶的狀態，可能會對酶的活性部位產生影響，導致部分酶失活；最后，酶在使用過程中需要在40℃條件下進行，長時間處于此溫度也會導致部分酶失活。

3　結　語

從以上分析可以看出，活化后的可溶可逆載體Eudragit S-100能夠成功用于豬胰脂肪酶的固定化修飾，固定化修飾之后，豬胰脂肪酶與載體進行了多點共價交聯，而且經過有序折疊，分子結構變得較為緊湊，這導致固定化酶具有較好的溫度穩定性和pH穩定性，但是酶活有一定損失。同時，固定化之后的脂肪酶保留了原載體pH響應的可溶可逆性，能夠比較方便的從溶液中進行回收，并且具有一定的重復使用性能。

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