米曲霉雙菌株組合制曲對產蛋白酶的影響

李　鵬， 張艷芳，　王選年*

（1.新鄉學院 生命科學技術學院，河南 新鄉453003；2.鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州450000）

米曲霉是食品用蛋白酶主要來源菌株，具有很強的蛋白酶合成能力，其所產蛋白酶能夠在較廣的pH值范圍內保持活力。蛋白酶是醬油釀造最重要的酶，對于醬油產品的品質以及生產成本具有決定性的作用[1]。目前國內傳統的醬油釀造采用的是單菌種滬釀3.042，但是其所產酶系過于單一，成品醬油香氣及色澤存在不足[2]。制曲是醬油釀造過程中最關鍵的步驟之一，成曲的優劣不僅對于氨基酸產生率和蛋白質利用率至關重要，而且還能影響到醬油揮發性風味成分的形成[3]。混合菌種制曲能夠完善酶系，彌補單菌種制曲酶系不完整、醬醅中酶類比例不協調的缺陷，促進成品醬油品質和出品率[4]。張齊軍[5]、程世杰[6]、靳文生[7]等采用米曲霉、黑曲霉等混合制曲完善了酶系、提高了蛋白酶產量，但有報道指出混合菌種制曲中添加黑曲霉不但不能有效改善醬油風味，且對色澤和香氣產生副作用[8]。

氨肽酶（aminopeptidase）是自然界中普遍存在的一種重要的蛋白酶類，能夠催化肽鏈氨基末端肽鍵進行水解。其中有些氨肽酶不僅能夠水解多肽，還能水解完整的蛋白酶[9]。由于肽段呈苦味的部分原因是由于肽鏈N末端的堿性氨基酸的存在，所以氨肽酶具有很強的脫苦能力[10]。米曲霉是氨肽酶重要的來源菌之一，早在20世紀70年代就有日本學者從米曲霉中分離出亮氨酰氨肽酶進行實驗研究[11]。唐文竹等通過對一株米曲霉菌株進行發酵條件優化，使其胞外氨肽酶活性較優化前提高了3倍以上[12]。

本研究中參考混合菌種協同作用的制曲方式，以2種米曲霉菌株為出發菌株進行組合制曲，來提高制曲中性蛋白酶和氨肽酶的酶活力，以期對提高醬油發酵蛋白質利用率有所幫助。

1　材料與方法

1.1　菌種

米曲霉 （Aspergillus oryzae） 菌株：CICC2339，CICC2066購于中國工業微生物菌種保藏中心。

1.2　培養基和菌種培養方式

1.2.1培養基

1）斜面培養基：PDA培養基。

2）制曲培養基：按照麩皮∶豆粕=4∶1的質量比在250 mL的錐形瓶中加入20 g過10目篩的干料，然后加入干料質量分數80%的蒸餾水，混勻，于121℃、0.1 MPa滅菌40 min。

1.2.2菌種培養方式用無菌水洗脫于4℃保存的米曲霉PDA斜面，制備成孢子懸液，采用血球板計數法計算孢子個數，調整孢子懸液濃度為1.28×107個孢子/mL。接種制備好的1 mL孢子懸液于制曲培養基中，混勻后30℃培養。

1.3　實驗方法

1.3.1粗酶液的提取方法中性蛋白酶粗酶液：取1 g 于 30 ℃培養后的固體干曲，按照 1∶20（g∶mL）加入0.1 mol/L pH 7.2的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，于40℃水浴中浸提1 h，間歇攪拌，用4層紗布過濾即得粗酶液。

氨肽酶粗酶液：取1 g于30℃培養后的固體干曲，按照 1∶20（g∶mL）加入 0.1 mol/L pH 7.2 磷酸鹽緩沖液，放置4℃過夜，4層紗布過濾得粗酶液。

1.3.2酶活性的測定方法

1）中性蛋白酶測定采用福林-酚法。參考中華人民共和國專業標準蛋白酶活力測定法（GB/T23527-2009）。中性蛋白酶的測定pH值為7.2。

酶活定義：1 g干曲在40℃、pH 7.2條件下，1 min水解酪素產生1 μg酪氨酸為一個酶活力單位。

2000年，小布什在美國總統大選期間大罵《紐約時報》記者為“白癡”。他罵道：“真是白癡。”隨即，小布什的競選搭檔切尼附和說：“沒錯，而且是第一！”兩人都不知，當時麥克風沒關。

計算公式：U=A×K×4/10×n（1）式（1）中，A：平均吸光度值；K：吸光常數；4：反應試劑的總體積；10：反應時間；n：酶液稀釋倍數。

2）氨肽酶測定采用亮氨酸對硝基苯胺法。酶活定義：在40℃、pH 7.2的條件下，每分鐘水解亮氨酸對硝基苯胺生成1 μg對硝基苯胺（pNA）所需的酶量定義為一個酶活力單位。

酶活力計算公式：U=A×V1×D/（k×t×V2）（2）式（2）中，V1：反應總體積；V2：酶液體積；D：酶液的稀釋倍數；k：消光系數；t：恒溫反應時間。

1.3.3單菌株制曲中性蛋白酶和氨肽酶活性檢測實驗分別取1 mL 1.28×107個孢子/mL的孢子懸液加入制曲培養基中，于30℃培養24 h后檢測中性蛋白酶和氨肽酶活性。

1.3.4雙菌株組合制曲實驗將與單菌株培養時孢子濃度相同的2株米曲霉菌株CICC2339和CICC2066的孢子懸液共1 mL按孢子數比例接種于制曲發酵培養基進行雙菌株組合制曲（見表1，孢子液體積比值），每個組合設3個重復，于30℃培養38、42 h和44 h，然后稱取1 g干曲進行中性蛋白酶和氨肽酶活性檢測。

表1　雙菌株組合曲孢子接種體積比例Table 1　Inoculation ratio of two strains-combination koji making

2　結果與討論

2.1　單菌株制曲中性蛋白酶和氨肽酶活性檢測結果

A（CISS2339）、B（CICC2066）單菌株制曲過程中性蛋白酶活性變化如圖1所示，A、B菌株制曲中性蛋白酶活性在42 h分別達到最高的830.8 U/g（干曲）和1 187.7 U/g（干曲）。中性蛋白酶能夠水解蛋白質產生肽段，B的中性蛋白酶活力較A菌株低，說明B菌株對蛋白質進行水解產生肽段的能力較弱。

圖1　單菌株曲中性蛋白酶活性Fig.1　Neutral protease activity of single strain koji

A、B單菌株制曲過程中氨肽酶活性變化如圖2所示，B菌株制曲氨肽酶活性在60 h達到201.4 U/mL，A菌株在42 h達到93.2 U/mL，雖然B菌株氨肽酶活性較高，但氨肽酶產量到達峰值的時間較長，且由于其中性蛋白酶活力較低，不能有效地利用氨肽酶高活性的優勢來水解多肽以及提高醬油釀造過程中游離氨基酸的生成率。

圖2　單菌株曲氨肽酶活性Fig.2　Aminopeptidase activity of single strain koji

2.2　組合制曲實驗結果

按表1所示的比例，將A和B菌株進行組合制曲培養，在38、42 h和44 h檢測制曲中性蛋白酶和氨肽酶活性，檢測結果見圖3和圖4。

圖3　組合曲中性蛋白酶活性Fig.3　Neutral protease activity of combination koji

圖4　組合曲氨肽酶活性Fig.4　Aminopeptidase activity of combination koji

由圖3所示，各編號組合制曲中性蛋白酶活性均在42 h達到最高，A6B4在所有組合中達到最高的1 366.8 U/g（干曲），圖4中A6B4在42 h氨肽酶活性達到最高的148.7 U/mL。A6B4在保持中性蛋白酶活性高的基礎下具有較高的氨肽酶活性，在醬油釀造過程中提高了對蛋白質的水解能力以及肽段水解產物中游離氨基酸的產量。

2.3　單菌株制曲與組合制曲實驗結果的比較

醬油釀造過程中不同蛋白酶扮演著不同的重要角色，所以制曲要綜合考慮中性蛋白酶和氨肽酶的活性情況。將制曲時間為42 h的A菌株和B菌株粗酶液按體積比6∶4直接混合后檢測中性蛋白酶和氨肽酶活性，檢測結果與A6B4進行比較，結果見表2。

表2　單菌株曲與組合曲蛋白酶活性比較Table 2　Comparison of protease activity between single strain koji and combination koji

由表2所示，A6B4制曲42 h其中性蛋白酶和氨肽酶活性均高于A、B單菌株培養和酶液混合，這說明A6B4組合在醬油釀造過程中其制曲中性蛋白酶和氨肽酶活性具有較大優勢。

3　結　語

通過調節制曲培養基接種孢子的體積比，對2株米曲霉菌株A、B進行組合制曲，以中性蛋白酶和氨肽酶活性為指標得到最優組合A6B4。A6B4在pH 7.2、30℃條件下制曲中性蛋白酶和氨肽酶活性在42 h分別達到最高的1 366.8 U/g（干曲）和148.7 U/mL，且均高于傳統醬油釀造米曲霉菌株As.3.042。A6B4既擁有A菌株高中性蛋白酶活性的特點，又具有B菌株高氨肽酶活性的優勢，不但在醬油釀造過程中能夠更有效地水解蛋白質產生多肽，而且氨肽酶活性的提高有助于水解醬油產物中的肽段產生游離氨基酸，從而達到去除產品苦味，提升風味的目的，這對于醬油品質的改善具有重要意義。

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