紅芪總黃酮對(duì)人白血病細(xì)胞誘導(dǎo)分化的分析及研究

鄧婉蓉 戴恩來(lái) 陳徹

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅 蘭州730000）

紅芪是多序巖黃芪干燥根，為同類產(chǎn)品中的上品。其有著排毒利尿，固表益氣以及排膿斂瘡的效果，進(jìn)而在臨床上被廣泛使用[1]。

總黃酮為紅芪內(nèi)主要成分，這種成分對(duì)于白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖以及分化等有著一定影響，相關(guān)作用機(jī)制也成為了當(dāng)前臨床中的熱點(diǎn)研究問(wèn)題。結(jié)合實(shí)際情況，本文全面分析紅芪總黃酮對(duì)人白血病細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響情況，為日后實(shí)驗(yàn)提供理論性依據(jù)，現(xiàn)將具體結(jié)果匯報(bào)如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選擇實(shí)驗(yàn)藥材紅芪為研究材料，經(jīng)鑒定，確認(rèn)其為上品。實(shí)驗(yàn)室完成紅芪總黃酮的分離、純化工作。檢測(cè)得出有效物質(zhì)量為88.30%。擇取2014年5月—2017年5月我院收治的100例白血病干細(xì)胞樣本進(jìn)行研究。

1.2 方法

擇取白血病患者白血病患者骨髓，開展KG-1a細(xì)胞培養(yǎng)，以免疫磁珠法分選白血病腫瘤干細(xì)胞并培養(yǎng)。計(jì)算紅芪總黃酮作用不同時(shí)間（總黃酮濃度為60、80以及100mg/L），同時(shí)以等量RPMI1640為對(duì)照，開展MTT法檢測(cè)紅芪總黃酮對(duì)白血病干細(xì)胞增殖的影響，對(duì)白血病干細(xì)胞周期以及凋亡情況進(jìn)行流式檢測(cè)，PCR檢測(cè)c-fos等相關(guān)基因mRNA并分析可誘導(dǎo)基因的表達(dá)量，利用western blotting技術(shù)檢測(cè)MAPK等相關(guān)蛋白表達(dá)，開展RNA干擾技術(shù)分別封閉c-fos等基因，westernblotting檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)，全面分析表達(dá)基因與c-fos之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS20.0專業(yè)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，開展方差檢驗(yàn)分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)，組間數(shù)據(jù)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.結(jié)果

2.1 細(xì)胞周期和凋亡率檢測(cè)情況

經(jīng)檢驗(yàn)證實(shí)，使用不同濃度的紅芪總黃酮處理后，HL-60細(xì)胞周期停滯在G0/G1以及G2/M期。存在濃度依賴關(guān)系，與之相對(duì)應(yīng)的S期細(xì)胞減少，但促細(xì)胞凋亡作用不顯著。詳細(xì)情況見表。

表 紅芪總黃酮對(duì)HL-60細(xì)胞周期和凋亡影響情況（±s，%）

表 紅芪總黃酮對(duì)HL-60細(xì)胞周期和凋亡影響情況（±s，%）

注：和對(duì)照組相比，△P＜0.05。△△P＜0.01。

未處理組41.9±4.252.2±3.16.0±1.4 2.2±0.3處理組6049.4±3.6△44.5±6.56.2±1.72.8±0.9 8060.6±9.1△△31.3±4.9△△ 8.2±1.2△3.8±1.2 10062.8±8.6△△26.6±2.1△△ 10.4±2.2△3.4±1.0

2.2 分化相關(guān)基因檢測(cè)

HL-60細(xì)胞使用濃度為60、80以及100mg/L的紅芪總黃酮處理之后，C-fos表達(dá)分別為24.03±2.81，32.34±2.55，38.73±3.14，未處理組為16.84±1.69.與未處理組相比，處理組相關(guān)數(shù)據(jù)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05.處理組之間的C-fos表達(dá)呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。

3.討論

紅芪中含有黃酮類化合物低分子天然植物成分。上述化合物主要有A苯環(huán)以及B苯環(huán)組成，經(jīng)三個(gè)碳原子相互連接，構(gòu)成的多酚類化合物。

總黃酮廣泛存在于紅芪皮、果實(shí)、葉以及根部。其在黃芪中主要以游離或者糖甙復(fù)合物形式存在[2]。因糖種類和連接位置存在差異，會(huì)結(jié)合形成多類黃酮苷。主要為黃酮醇類、黃酮類、雙黃酮類、異黃酮類等相應(yīng)的醇類。就黃酮類化合物來(lái)講，主要包含金雀異黃素、蛇葡萄素、兒茶素、槲皮素等等。

黃酮類化合物為天然植物陳分，毒性小，為當(dāng)前人們比較關(guān)注的化合物之一。

此類成分對(duì)于白血病細(xì)胞增殖、分化以及凋亡方面的影響機(jī)制，也成為了當(dāng)研究熱點(diǎn)，但值得說(shuō)明的是，迄今為止，臨床上對(duì)于紅芪所含有的總黃酮對(duì)于白血病細(xì)胞作用研究不多[3]。

本文指出，HL-60細(xì)胞使用總黃酮作用處理之后，CD11b的表達(dá)量上升，NBT的還原水平明顯降低，證實(shí)使用紅芪總黃酮對(duì)早幼粒細(xì)胞進(jìn)行處理，能令其取得成熟粒細(xì)胞的表面標(biāo)志著以及相關(guān)功能。經(jīng)處理后，HL-60細(xì)胞會(huì)停滯在G0/G1期、G2/M期，S期細(xì)胞明顯減少，進(jìn)而令細(xì)胞增殖速度減少，趨向于分化狀態(tài)[4]。

細(xì)胞增殖和分化會(huì)受到有關(guān)基因調(diào)控影響。而C-fos原癌基因?qū)儆诘鞍踪|(zhì)Fos，編碼分子量為55KD，其中包含380個(gè)氨基酸殘基。C-fos對(duì)于某些生長(zhǎng)因子以及分化誘導(dǎo)刺激反應(yīng)早期應(yīng)答基因。這種基因產(chǎn)物和誘導(dǎo)分化存在極強(qiáng)相關(guān)性。其在成熟的粒細(xì)胞與單核細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)。而在沒(méi)有分化的人早幼粒細(xì)胞中并不表達(dá)其編碼的蛋白質(zhì)DNA結(jié)合性蛋白。其主要以第三信使方式調(diào)控基因表達(dá)[5]。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)總黃酮作用后，HL-60細(xì)胞的C-fos蛋白表達(dá)量上升，提示這種基因可能為總黃酮作用靶分子。值得說(shuō)明的是，很多細(xì)胞外信號(hào)會(huì)對(duì)C-fos表達(dá)起到促進(jìn)作用。另外，經(jīng)過(guò)MAPK，PKA和PKC通路，也能令c-Fos發(fā)生磷酸化反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)其活性造成影響。Fos家族成員可能和C-jun二聚化，進(jìn)而形成AP-1轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)涉及到分化以及增殖的基因加以表達(dá)。

由此能夠看出，上述通路與有關(guān)基因是否能夠和紅芪總黃酮作用有關(guān)，為日后研究方向，其也勢(shì)必成為紅芪總黃酮誘導(dǎo)白血病分化提供更加有力的證據(jù)。

】

[1]崔笑梅，王志平，張志華，等.紅芪多糖增強(qiáng)LAK細(xì)胞對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥藥理與臨床，1999，15(2)：18.

[2]海力茜，梁鴻，趙玉英，等.多序巖黃芪化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志，2002，27(11)：843

[3]王瑋，王琳.黃酮類化合物的研究進(jìn)展[J].沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，4（2）：115.

[4]楊向東，李紅玉，李德冠，等.蝎毒多肽對(duì)白血病細(xì)胞株KG1a干細(xì)胞活性的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015(4)：1278-1281.

[5]張宇，田劭丹，侯麗，等.川芎嗪對(duì)急性髓性白血病KG-1a細(xì)胞表面標(biāo)志物的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，15(5)：844-848.