熱帶假絲酵母菌感染臨床檢驗調查

羅云 王瑜敏 羅盛

隨著免疫抑制劑、激素、廣譜抗菌藥物的大量應用，以及器官移植技術的開展、各種導管的應用及腫瘤化療等，使各種條件致病菌尤其是真菌感染日趨嚴重［1-2］。當前臨床感染的真菌雖以白色假絲酵母菌感染為主，但非白色假絲酵母菌感染比率逐年上升。有研究報道稱，熱帶假絲酵母菌是導致假絲酵母菌感染的第二常見原因［3］。為探討熱帶假絲酵母菌的臨床感染及其對抗真菌藥物的耐藥狀況，為預防與控制醫院真菌感染提供依據，本資料對本院2013年7月至2016年7月收治的47例熱帶假絲酵母菌進行了回顧性的臨床調查，并對分離菌株進行了生化特性和對抗真菌藥物的敏感情況分析，現將結果報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選自溫州醫科大學附屬第一醫院2013年7月至2016年7月收治的血培養“熱帶假絲酵母菌”陽性病例共47例。其中男31例，女16例，年齡中位數51歲；＜20歲患者5例，21～40歲4例，41～60歲29例，≥61歲9例；血液內科24例，重癥監護12例，急診、呼吸、消化和胃腸外科等總共11例。

1.2 方法 （1）菌株和培養：對患者的血培養分離真菌采用VITEK2全自動鑒定儀及配套酵母樣真菌鑒定卡YST作假絲酵母菌屬菌種鑒定，確定其為“熱帶假絲酵母菌”菌屬。分離菌株保存于瓊脂糖平板（含1%蛋白胨和2%葡萄糖，YCB agar，Difco Laboratories，USA），在含1%蛋白胨和2%葡萄糖的YCB液體培養基（YCB，Difco Laboratories）中37℃預培養24h，離心收集菌體，用PBS洗兩次，調整菌體數用于生化特性鑒定。（2）真菌生化特性的鑒定：生化特性鑒定包括蛋白酶、脂肪酶和葡糖苷酶活性鑒定。蛋白酶活性鑒定：取預培養的真菌，在含5% 牛血清蛋白（BSA；Sigma Chemical Co.，USA）的YCB液體培養基中培養4d，取0.2ml上清液與1ml含5% BSA的乙酸鈉（1M，pH4.0）溶液在37℃共培養1h，之后加入1.0 ml 三氯乙酸（10%，TCA； Sigma）終止反應。離心后取上清液檢測750nm吸光度值；脂肪酶活性鑒定：取預培養的真菌，在含2.5% Tween-80的YNB培養基（0.7%YNB，Difco Laboratories）中37℃培養3d，之后用lipase assay kit（Toyobo，Osaka，Japan）檢測其脂肪酶活性；葡糖苷酶活性鑒定：取預培養的真菌，在含0.6% 麥芽糖的YNB培養基（0.7%YNB，Difco Laboratories）中37℃培養16h，取上清液，與含5mM吡喃葡糖苷的檸檬酸鹽溶液（pH6.0）在37℃反應30min，0.1M的Na2CO3終止反應，測其在405nm的吸光度值。所有試驗中均采取實驗室保存分離的白色假絲酵母菌作為對照。（3）體外抗真菌藥物敏感性檢測：采用ATBTM FUNGUS3真菌藥敏卡進行常用抗真菌藥物體外敏感性檢測，包括5-氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑。（4）治療情況和預后分析：采用卡泊芬凈針和卡泊芬凈針聯合兩性霉素B治療后患者預后轉歸情況，死亡比例及死亡原因進行統計分析。

1.3 統計學方法 采取SPSS19.0統計軟件。計數資料組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌株生化特性鑒定 對分離的真菌培養物全部進行生化特性鑒定，包括蛋白酶活性，脂肪酶活性和葡糖苷酶活性。每株真菌培養物進行3次平行試驗測試，取平均值進行記錄分析。本資料分離的熱帶亞熱帶假絲酵母菌的蛋白酶活性顯著低于白色假絲母菌（P＜0.05），葡糖苷酶活性顯著高于白色假絲酵母菌（P＜0.05），脂肪酶活性無顯著差異。

2.2 菌株耐藥性分析 分離的47株真菌，均對5-氟胞嘧啶和兩性霉素B敏感，對氟康唑敏感為63.8%（30/47），對伊曲康唑敏感為59.6%（28/47），對伏立康唑敏感為68.1%（32/47），見表1。最小抑菌濃度（MIC）：5-氟胞嘧啶完全敏感濃度≤2μg/ml；氟康唑完全敏感濃度≤8μg/ml，劑量依賴性敏感濃度16～32μg/ml，抵抗濃度 ＞32μg/ml；伏立康唑完全敏感濃度≤1μg/ml，劑量依賴性敏感濃度2～4μg/ml，抵抗濃度＞4μg/ml；伊曲康唑完全敏感濃度≤0.125μg/ml，劑量依賴性敏感濃度0.25～0.5μg/ml，抵抗濃度＞0.5μg/ml。兩性霉素B完全敏感濃度≤ 1μg/ml。

表1 菌株耐藥性分析

2.3 治療方法與預后分析 對患者采取卡泊芬凈針和卡泊芬凈針聯合兩性霉素B針抗真菌治療，治療結果表明，23例患者預后良好（49.0%），24例患者死亡（51.0%），主要死亡原因為感染性休克和多臟器功能衰竭，見表2。

表2 治療方案與預后分析（n）

3 討論

熱帶假絲酵母菌是一種腐物寄生菌，廣泛分布于自然界，也可存在于健康人體的體表皮膚和外界相通的腔道中，如口腔、消化道、陰道等部位。當機體抵抗力下降或局部環境發生改變時，熱帶假絲酵母菌易致病是一種條件致病菌，而且，熱帶假絲酵母菌感染的發生率和病死率要高于白色假絲酵母菌。熱帶假絲酵母菌常引起免疫功能減弱患者肺部感染、血液感染、泌尿系統感染、生殖系統感染、眼部感染乃至全身感染。目前國內外對熱帶假絲酵母菌引起的感染以研究血液感染居多［4］。

熱帶假絲酵母菌呈圓形或卵圓形，直徑3～6μm，革蘭氏染色陽性，著色不均勻。沙氏瓊脂上呈奶油樣，灰白色，柔軟，菌落光滑，邊緣或有皺褶，而在吐溫80玉米粉瓊脂平板上可見大量菌絲，上附芽生孢子，不產生厚膜孢子。在血清中不產生典型的芽管； 少數菌株圓形孢子出芽處明顯狹窄，“芽管”較粗。能同化葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖、木糖、海藻糖，尚同化纖維二糖，不同化L-阿拉伯糖和鼠李糖。該菌除可在黏膜細胞上增殖引起感染外，其產生的毒素可引起過敏反應及產生水解酶類，引起組織損傷，重者可導致患者死亡［5］。

本資料中患者多分布于血液內科，ICU次之，其余來源于急診、呼吸、消化和胃腸外科等。這些患者的共同特點是：長期患病，病情較重，年老體弱，免疫力極度低下，定期放化療，長期應用免疫抑制劑，皮質激素，長期反復使用多種廣譜抗菌藥物，破壞了機體自然保護屏障，導致體內微生態平衡紊亂，造成菌群失調，抑制了常見的條件致病菌，使假絲酵母菌屬大量繁殖。此外，臨床創傷性診療手段的廣泛開展，如氣管插管、氣管切開、各種插管的留置等因素降低了機體正常防御功能，為假絲酵母菌屬的侵入提供了條件。

熱帶假絲酵母菌的生化反應顯示，本資料中分離的熱帶假絲酵母菌的蛋白酶活性顯著低于白色假絲酵母菌（P＜0.05），葡糖苷酶活性顯著高于白色假絲酵母菌（P＜0.05），脂肪酶活性無顯著差異。體外藥物敏感試驗提示，分離的47株真菌，均對5-氟胞嘧啶和兩性霉素B敏感，說明5-氟胞嘧啶和兩性霉素B是治療深部真菌的首選藥物，5-氟胞嘧啶不良反應輕，而兩性霉素B不良反應較大，但5-氟胞嘧啶較少單獨用藥，一般與兩性霉素B 聯合應用；對氟康唑的敏感率為63.8%（30/47），對伊曲康唑的敏感率為59.6%（28/47），對伏立康唑的敏感率為68.1%（32/48），氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑是三唑類藥物，在臨床上廣泛應用，其作用于細胞色素P450 酶和14α-脫甲基酶，最終使麥角醇合成受阻，造成甲基戊酸在細胞內的堆集，使膜結構破壞，抑制真菌生長，這是三唑類藥物的共同作用機制，亦是造成交叉耐藥的理論基礎。隨著越來越多的抗真菌藥物被應用于臨床，深部真菌的耐藥性也在明顯增加，尤其是對作為一線藥物的氟康唑。目前，就氟康唑的使用是否是導致非白假絲酵母菌感染比例上升的原因仍存在爭議。實際上臨床治療真菌感染并不容易，因為每種抗真菌藥物都有一定的毒性作用，而其毒性作用限制了用量和使用方式，使感染部位藥物濃度偏低，而達不到殺菌程度。作者在臨床上采取對患者進行卡泊芬凈針和卡泊芬凈針聯合兩性霉素B針抗真菌治療，治療結果表明，23例患者預后良好（49.0%），24例患者死亡（51%），造成死亡的主要原因為感染性休克和多臟器功能衰竭。

有關體外藥敏試驗與臨床療效的一致性尚需進一步研究。熱帶假絲酵母菌作為重要的非白假絲酵母菌，感染日益增多，且會導致比其它假絲酵母菌更高的病死率，因此臨床需要尤其重視其感染情況，機體的抵抗力與免疫力低下與真菌感染有重要關系，因此對于年齡大、免疫力低下、住院時間長、長期使用抗生素等危險因素的患者，臨床醫生需尤其注意真菌的感染。微生物實驗室應加強對此類菌株的檢測，并將酵母菌屬鑒定至種的水平。同時為預防與控制耐藥菌株的進一步增加，給臨床治療提供依據，及時準確地了解和掌握醫院真菌感染和耐藥情況至關重要。

［1］ Laupland KB, Gregson DB, Church DL, et al． Invasive Candida species infections: a 5 year population-based assessment． Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2005, 56(3): 532-537．

［2］ Wang JL, Chang SC, Hsueh PR, et al． Species distribution and fluconazole susceptibility of Candida clinical isolates in a medical center in 2002． Journal of microbiology, immunology, and infection, 2004, 37(4): 236-241．

［3］ 李文革, 程穎, 吳媛, 等． 王靖醫院內假絲酵母菌感染的菌種構成和耐藥性分析． 疾病監測, 2013, 28(8): 684-687．

［4］ Chiu YS, Chang SC, Hsueh PR, et al． Survey of amphotericin B susceptibility of Candida clinical isolates determined by E-test．Journal of microbiology, immunology, and infection, 2006, 39(4):335-341．

［5］ Mandelblat M, Frenkel M, Abbey D, et al． Phenotypic and genotypic characteristics of Candida albicans isolates from bloodstream and mucosal infections． Mycoses, 2017, 60(8): 534-535．