固相萃取-高效液相色譜法測定蜂蜜中克倫特羅殘留量及條件優化

(鎮江市產品質量監督檢驗中心，鎮江 212132)

克倫特羅(Clenbuterol)既不是獸藥，也不屬于添加劑，而是一種激素類物質，俗稱“瘦肉精”，該物質能促進動物體內脂肪分解代謝，增加蛋白質合成，提高瘦肉率，然而人體食用高殘留量的內臟組織或者累計攝入量超過一定值時便可能引發食物中毒事件[1-3]。1997 年我國明令禁止在畜牧行業生產、銷售和使用克倫特羅，但是非法使用克倫特羅的事件仍時有發生[4]。

現行有效的標準中測定克倫特羅的方法有酶聯免疫法、膠體金免疫層析法、液相色譜法和質譜法[5-8]，針對不同的樣品基質和實驗室條件可以選擇合適的測定方法。國家標準GB/T 22944—2008中采用液相色譜-串聯質譜法測定蜂蜜中克倫特羅的殘留量[9]，該方法對儀器條件要求較高，而關于高效液相色譜法測定蜂蜜中克倫特羅的文獻并不多見，于是嘗試建立固相萃取-高效液相色譜法測定蜂蜜中克倫特羅的方法并對測試條件進行優化。

1 實驗方法

1.1 儀器和試劑

Waters e2695液相色譜儀(主要包括2998光電二極管矩陣檢測器，柱溫箱，自動進樣器，自動脫氣四元梯度泵等，美國Waters公司)；微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；12位固相萃取真空裝置(上海安譜實驗科技股份有限公司)；12位干浴氮吹儀(上海安譜實驗科技股份有限公司)； Millpore超純水系統(美國Millpore公司)。

甲醇中鹽酸克倫特羅標準溶液(250μg/mL，北京壇墨質檢科技有限公司)；甲醇、乙酸乙酯和乙酸為色譜純(美國Tedia公司)；無水乙醇、鹽酸、乙酸鈉、乙酸銨、磷酸二氫鈉、氨水和磷酸為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；實驗用水為Millpore超純水系統制得，18MΩ·cm，25 ℃；CNWBOND WCX(500mg，6mL)、CNWBOND SCX(500mg，6mL)、CNW Poly-Sery MCX(60mg，3mL)和CNW Poly-Sery HLB(500mg，6mL) 固相萃取柱(上海安譜實驗科技股份有限公司)；Oasis MCX(60mg，3mL)和Oasis HLB(200mg，6mL)固相萃取柱(美國Waters公司)。

1.2 色譜條件

色譜柱：CNW Athena C18-WP (250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇：磷酸二氫鈉(0.02mol/L)=40∶60；流速：1.0mL/min；進樣體積：20μL；柱溫：30℃；檢測波長：210nm。

1.3 樣品前處理

稱取約2g蜂蜜樣品于50mL離心管中，加入20mL乙酸鈉緩沖溶液(0.2mol/L，pH=5.0)，漩渦混勻，蜂蜜完全溶解后備用，待凈化。

采用不同填料的固相萃取柱進行凈化，固相萃取柱填料不同，活化和凈化方法也有所區別，具體實驗方法如下：

(1)WCX固相萃取柱

依次用5mL乙醇和5mL水活化固相萃取柱，將上述蜂蜜提取液全部轉移至活化后的固相萃取柱中，分別用5mL水和5mL 乙醇淋洗固相萃取柱，棄去淋洗液，真空抽干2min，最后用10mL氨水-乙醇溶液(體積比2∶98)進行洗脫，收集洗脫液。洗脫液在50℃下氮氣吹干，準確加入1mL水溶解殘渣，過0.22μm濾膜后進樣測定。

(2)SCX固相萃取柱

依次用5mL甲醇、5mL水和5mL 0.03mol/L鹽酸溶液活化固相萃取柱，將上述蜂蜜提取液全部轉移至活化后的固相萃取柱中，分別用5mL水和5mL甲醇淋洗固相萃取柱，棄去淋洗液，真空抽干2min，最后用10mL氨水-甲醇溶液(體積比5∶95)進行洗脫，收集洗脫液。洗脫液在50℃下氮氣吹干，準確加入1mL水溶解殘渣，過0.22μm濾膜后進樣測定。

(3)MCX固相萃取柱

依次用3mL甲醇、3mL水和3mL 0.1mol/L鹽酸溶液活化固相萃取柱，將上述蜂蜜提取液全部轉移至活化后的固相萃取柱中，分別用3mL 0.1mol/L鹽酸溶液、3mL水和3mL50%甲醇淋洗固相萃取柱，棄去淋洗液，真空抽干2min，最后用5mL氨水-甲醇-乙酸乙酯溶液(體積比5∶45∶50)進行洗脫，收集洗脫液。洗脫液在50℃下氮氣吹干，準確加入1mL水溶解殘渣，過0.22μm濾膜后進樣測定。

(4)HLB固相萃取柱

依次用5mL甲醇和5mL水活化固相萃取柱，將上述蜂蜜提取液全部轉移至活化后的固相萃取柱中，分別用5mL水和5mL甲醇淋洗固相萃取柱，棄去淋洗液，真空抽干2min，最后用10mL氨水-甲醇溶液(體積比5∶95)進行洗脫，收集洗脫液。洗脫液在50℃下氮氣吹干，準確加入1mL流動相溶解殘渣，過0.22μm濾膜后進樣測定。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的確定

采用Waters 2998二級管陣列檢測器的3D掃描功能，在波長190～400nm范圍內對高濃度的克倫特羅標準工作溶液進行測定，并在克倫特羅出峰位置提取光譜圖，見圖1。從圖1中可以看出，克倫特羅的最大吸收波長在210nm附近，因此選擇210nm作為檢測波長，此時克倫特羅的響應值最大。

2.2 流動相對克倫特羅標準工作溶液測定的影響

以甲醇-水、甲醇-乙酸鹽和甲醇-磷酸鹽為流動相，從pH值、流動相比例和方法重復性3個方面考察流動相對克倫特羅標準工作溶液測定的影響。實驗結果表明，以甲醇-水為流動相時，色譜圖中并沒有明顯的克倫特羅色譜峰，當流動相中加入磷酸后克倫特羅開始出峰；隨著磷酸加入量的增加，其保留時間提前并且峰高與峰面積也隨著增加；當進一步提高流動相中磷酸含量時，克倫特羅的保留時間逐漸延長，但是峰面積保持不變。這是由于克倫特羅呈弱酸性，在水溶液中以離子形態存在，降低了在C18色譜柱上的保留行為，而磷酸的加入能夠抑制克倫特羅的電離，使其以分子的形態存在，增加克倫特羅在C18色譜柱上的保留，并改善峰形。以甲醇-乙酸鹽和甲醇-磷酸鹽為流動相時，克倫特羅的電離得到抑制，峰形較好，pH值對保留時間和峰面積的影響也較小。

圖1 克倫特羅標準工作溶液的3D掃描圖(a)和吸收光譜圖(b)

采用上述3種流動相進行測定時，改變流動相中甲醇含量對克倫特羅的保留時間和峰形具有很大的影響。隨著流動相中甲醇含量的減少，克倫特羅的保留時間逐漸延長，峰寬變寬，峰高變小，方法的靈敏度變低。以甲醇-水流動相為例，當流動相pH=2.8，甲醇含量為20%時，克倫特羅的保留時間為17min左右；甲醇含量為45%時，克倫特羅的保留時間提前到3min左右，而且與溶劑峰重疊，不利于定性和定量分析，實驗結果見圖2。

圖2 流動相比例對克倫特羅標準工作溶液測定的影響流動相中甲醇含量分別為(a).20%;(b).25%;(c).30%;(d).35%;(e).40%;(f).45%

采用Waters e2695液相色譜儀的自動進樣器，吸取一定濃度的克倫特羅標準工作溶液，連續6針進樣，在上述3種流動相條件下進行測試，考察方法的重復性。實驗結果表明，甲醇-水流動相條件下，當流動相pH=2.8，甲醇含量為30%時，克倫特羅的保留時間不穩定，隨著進樣次數的增加，保留時間不斷前移，6針進樣后克倫特羅保留時間的相對標準偏差(RSD)值為1.3%。甲醇含量增加至40%時，雖然能夠提高方法的重復性，但是保留時間較短，容易受到樣品中雜質組分的干擾。甲醇-乙酸鹽和甲醇-磷酸鹽流動相條件下克倫特羅的保留時間穩定，連續6針進樣，克倫特羅保留時間的RSD值分別為0.1%和0.3%。

2.3 流動相對蜂蜜中克倫特羅殘留量測定的影響

蜂蜜及蜂蜜加標樣品，經過固相萃取柱富集、凈化、濃縮后，分別采用上述3種流動相進行測定，考察流動相對蜂蜜中克倫特羅殘留量測定結果的影響，實驗結果見圖3。實驗結果表明，以甲醇-水為流動相，當流動相pH=2.8，甲醇含量為40%時，蜂蜜樣品提取后直接進樣測定色譜圖中，在克倫特羅保留時間處有一個很大的雜質峰，雖然該雜質峰經HLB固相萃取柱凈化后消失，但是實際檢測時該雜質峰對克倫特羅測定仍然存在隱患，如果凈化不干凈，就可能出現假陽性的結果，同時，在該流動相條件下，樣品在2～6min內有許多雜質峰，影響克倫特羅與雜質組分之間的分離度。當流動相為甲醇-乙酸鹽時，克倫特羅的測定受到雜質組分的影響很大，克倫特羅出峰時基線較高，而且與雜質組分不能基線分離；降低流動相中甲醇含量，樣品中克倫特羅的靈敏度明顯降低。當流動相為甲醇-磷酸鹽時，克倫特羅與樣品中的雜質實現基線分離，其保留時間附近的干擾組分較少，靈敏度能夠滿足殘留量檢測的要求。同時，在此色譜條件下，蜂蜜加標樣品只需經過簡單的提取便能直接測定，給高殘留值蜂蜜樣品的測定提供了便捷的方法。結合上述實驗，最終選擇采用甲醇-磷酸鹽為流動相對蜂蜜中克倫特羅殘留量進行測定。

圖3流動相對蜂蜜中克倫特羅殘留量測定的影響(a).甲醇-水;(b).甲醇-乙酸鹽;(c).甲醇-磷酸鹽

2.4 固相萃取柱對蜂蜜中克倫特羅殘留量測定的影響

以甲醇-磷酸鹽為流動相，測定固相萃取柱凈化后的蜂蜜加標樣品，考察固相萃取柱對蜂蜜中克倫特羅殘留量測定的影響，實驗結果見圖4。從圖4中可以看出，CNWBOND SCX固相萃取柱凈化后雜質組分的響應值依然很大，SN/T 1924-2007中采用了C18和SCX固相萃取柱串聯的方法進行凈化[10]，而本實驗僅采用了SCX固相萃取柱進行凈化，這可能是導致雜質去除不完全的原因之一；采用其他幾種固相萃取柱凈化后，色譜圖中雜質峰的響應值明顯降低，其中采用WCX固相萃取柱凈化后的色譜圖中雜質少，基線比較平整。對比相同填料不同品牌固相萃取柱凈化后的色譜圖可以發現，兩種品牌的固相萃取柱對雜質去除能力難分伯仲。

2.5 標準曲線的繪制

準確吸取1.0mL鹽酸克倫特羅標準溶液于25mL容量瓶中，用水稀釋成濃度為10.0μg/mL的標準儲備溶液。吸取適量體積克倫特羅標準儲備溶液，用水稀釋配成相應濃度的標準工作溶液，并按上述選定的色譜條件進行測定。以樣品峰面積Y(mV)對質量濃度X(μg/mL)作圖，得到線性回歸方程Y=146893X+311，相關系數R2=0.9991，結果表明：克倫特羅含量在0.10～1.00μg/mL之間時，該方法呈現良好的線性關系。

圖4固相萃取柱對蜂蜜中克倫特羅殘留量測定的影響(a).CNWBOND WCX;(b).CNWBOND SCX;(c).CNW Poly-Sery MCX;(d).CNW Poly-Sery HLB;(e).Oasis MCX;(f).Oasis HLB

2.6 回收率及固相萃取柱性能測定

稱取約2g蜂蜜樣品，共12份，往每份樣品中加入0.50mL濃度為1.0μg/mL的克倫特羅標準工作溶液，樣品經乙酸鈉緩沖溶液提取后，分別采用上述6種固相萃取柱對樣品進行凈化，每種固相萃取柱做2平行，并以甲醇-磷酸鹽為流動相進行測定，考察固相萃取柱的回收率，實驗結果見表1。測定結果表明，6種固相萃取柱均具有較好的回收率，回收率大于85%，其中MCX和HLB固相萃取柱的回收率明顯高于其他兩種填料的固相萃取柱；實驗中所使用的相同填料不同品牌的固相萃取柱回收率結果相近。

表1 回收率測定結果 %

3 結論

(1)本實驗建立了固相萃取-高效液相色譜法測定蜂蜜中克倫特羅的方法，分別以甲醇-水、甲醇-乙酸鹽和甲醇-磷酸鹽為流動相，考察了流動相對測定結果的影響。實驗結果表明，以甲醇-水為流動相時，流動相對pH值的緩沖能力較弱，克倫特羅的保留時間發生漂移；以甲醇-乙酸鹽為流動相時，基線噪音較大，方法靈敏度低；以甲醇-磷酸鹽為流動相時，方法重復性好，靈敏度較高。

(2)實驗中考察了固相萃取柱填料和品牌對蜂蜜中克倫特羅殘留量測定的影響。實驗結果表明，固相萃取柱對蜂蜜中克倫特羅殘留量的測定結果有很大的影響，4種不同填料的固相萃取柱中，MCX和HLB固相萃取柱的回收率較高，WCX和SCX固相萃取柱的回收率略低，相同填料不同品牌的固相萃取柱回收率結果相近。

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[7]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.SN/T 1924-2011進出口動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法[S].北京：中國標準出版社,2011.

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[9]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局與中國國家標準化管理委員會.GB/T 22944-2008蜂蜜中克倫特羅殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法[S].北京:中國標準出版社,2009.

[10]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.SN/T 1924-2007進出口動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留量的檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法[S].北京：中國標準出版社，2007.