磺胺類藥物HCD高能裂解與CID裂解的差異性研究

錫全

(1. 北京出入境檢驗檢疫局,北京 100026;2. 國家質檢總局國際檢驗檢疫標準與技術法規研究中心,北京 100088)

1 引言

高能誘導裂解技術(Higher energy Collision induced Dissociation，HCD)是一項新型的質譜裂解技術，與離子阱質譜常用的碰撞誘導解離技術(collision induced dissociation，CID)相比，HCD技術提供了穩定的高能裂解方式，并可改善CID裂解中產生的低質量碎片丟失(cut-off)效應，與Orbitrap質量分析器結合還可提供高分辨質譜數據[1-3]。HCD技術在蛋白質、肽段的鑒定和測序領域具有突出優勢，在代謝物鑒定、食品添加物分析也有文獻報道[1-13]。HCD裂解是通過離子阱進行離子的捕獲和選擇后，在特定的HCD裂解池中進行高能裂解，經Orbitrap質量分析器得到高分辨的串聯質譜圖，被稱為是一種類三重四極桿模式(triple quadruple like)的裂解技術[4]。

磺胺類(sulphonamides，SAs)是目前廣泛應用在畜禽抗感染治療中的重要藥物之一，在家禽養殖業方面，SAs可預防球蟲病、霍亂和感染性鼻炎，但SAs有副作用，可導致過敏反應和造血紊亂。國際食品法典委員會(CAC)和許多國家對食品和飼料中的SAs含量作了明確的規定[9, 10]。

有關SAs在三重四級桿和離子阱質譜中的裂解方式已有文獻報道[14-22]，但其高能裂解機理還未見報道。本實驗通過對SAs藥物結構母核鑒定技術的研究，掌握LTQ-Orbitrap XL多級高分辨質譜對藥物特征基團的判定在獸藥中的應用，對常見的6種SAs在高能裂解池中的裂解規律進行了研究，得到更為豐富的離子信息，并對比了HCD和CID兩種裂解模式的差異。同時，通過研究已知SAs的裂解途徑和規律，對未知SAs的裂解途徑和結構解析研究也有很大的參考和指導作用。為我國的食品安全監控提供定性確證檢測手段。

2 實驗部分

2.1 儀器和設備

LTQ-Orbitrap XL線性離子阱-軌道離子阱高分辨組合式質譜儀(美國Thermo Fisher公司)，配置電噴霧離子源(ESI源)。

2.2 試劑與材料

所有SAs標準品均購自Dr. Ehrenstorfer公司，純度均在98%以上。其他試劑均為色譜純，標準品溶于50%甲醇水溶液。試驗用水為Milli-Q超純水。

2.3 質譜條件

LTQ-Orbitrap XL線性離子阱-軌道離子阱高分辨組合式質譜儀(美國ThermoFisher Scientific公司)，配置電噴霧離子源(ESI源)。ESI正離子模式下蠕動泵直接進樣，流速10 μL·min-1。噴霧電壓4.5 kV，毛細管溫度150℃，殼氣流速10 arb，HCD裂解碰撞氣為高純氮氣，HCD歸一化碰撞能量55.0%。CID裂解碰撞氣為高純氦氣，CID歸一化碰撞能量55.0%。

3 結果與討論

3.1 磺胺胍

英文名稱：sulfaguanidne monohydrate

結構式：

分子量：214.05245，母離子：[M+H]+=215.05972

對[M+H]+進行二級質譜掃描(HCD)，m/z215.05965是[M+H]+峰，在分辨率為30,000時高分辨質譜測得的質量誤差為-0.33mg/kg，符合最新的歐盟(SANCO/10684/2009)化合物確證指令。碎片離子m/z156.01122、m/z108.04418、m/z92.04927和m/z65.03833是磺胺類化合物共有的特征碎片離子。碎片離子m/z156.01122是S-N鍵斷裂后，正電荷保留在含S端而形成的[C6H6NSO2]+；碎片離子m/z108.04418是離子[C6H6NSO2]+再失去一分子SO后產生的[C6H6NO]+；碎片離子m/z92.04927則是離子[C6H6NSO2]+失去一分子SO2產生的[C6H6N]+；碎片離子m/z65.03833則是離子[C6H6N]+裂解產生的[C5H5]+。推導裂解途徑如圖1。

當HCD和CID的碰撞能量均為55%時，CID裂解生成碎片離子m/z156.01118。推斷其裂解機理為：S-N鍵斷裂，生成[C6H6NSO2]+m/z156.01118。

HCD與CID相比(圖2)，具有共同的碎片離子峰m/z156.01138，都是在-SO2-基團兩端進行的裂解。除此之外，HCD還生成了m/z108.04418、m/z92.04927和m/z65.03833碎片離子。在相同碰撞能量的CID模式下，未得到這些離子碎片，且HCD譜圖更為直觀清晰。

圖1 磺胺胍的HCD質譜裂解途徑

圖2 磺胺胍在HCD(A)與CID(B)模式下的質譜圖比較(碰撞能量：55%eV)

3.2 磺胺吡啶

英文名稱：sulfapyridine

結構式：

分子量：249.05720，母離子：[M+H]+=250.06447

對[M+H]+進行二級質譜掃描(HCD)，m/z250.06444是[M+H]+峰，在分辨率為30,000時高分辨質譜測得的質量誤差為-0.12mg/kg，符合最新的歐盟(SANCO/10684/2009)化合物確證指令。碎片離子m/z156.01111、m/z108.04418、m/z92.04925和m/z65.03830是磺胺類化合物共有的特征碎片離子。碎片離子m/z156.01111是S-N鍵斷裂后，正電荷保留在含S端而形成的[C6H6NSO2]+；碎片離子m/z108.04418是離子[C6H6NSO2]+再失去一分子SO后產生的[C6H6NO]+；碎片離子m/z92.04925則是離子[C6H6NSO2]+失去一分子SO2產生的[C6H6N]+；碎片離子m/z65.03830則是離子[C6H6N]+裂解產生的[C5H5]+。除上述共有的特征碎片離子外，磺胺吡啶還產生了其他豐度較高的碎片離子，這些碎片離子反應了R基的取代信息：離子碎片m/z95.06021是S-N鍵斷裂后失去C6H5NO2S，正電荷保留在含N端產生的[C5H7N2]+；離子碎片m/z184.08679是S-N鍵和C-S鍵同時斷裂，失去HSO2，發生偶氮反應形成的[C11H10N3]+。推導裂解途徑如下(圖3)：

當HCD和CID的碰撞能量均為55%時，CID裂解主要生成碎片離子m/z156.01141、m/z184.08696和m/z108.04425。推斷其裂解機理為：S-N鍵斷裂，生成[C6H6NSO2]+m/z156.01138；碎片離子m/z156.01161失去一分子SO或SO2產生的[C6H6NO]+m/z108.04424。

HCD與CID相比(圖4)，具有共同的碎片離子峰m/z156.01138、m/z184.08692和m/z108.04439，都是在-SO2-基團兩端進行的裂解。除此之外，HCD還生成了m/z95.06021、m/z92.04925和m/z65.03830碎片離子+。在相同碰撞能量的CID模式下，未得到該離子碎片，且HCD譜圖更為直觀清晰。

圖3 磺胺吡啶的HCD質譜裂解途徑

圖4 磺胺吡啶在HCD(A)與CID(B)模式下的質譜圖比較(碰撞能量：55%eV)

3.3 磺胺嘧啶

英文名稱：sulfadiazine

結構式：

分子量：250.05245，母離子：[M+H]+=251.05972

對[M+H]+進行二級質譜掃描(HCD)，m/z251.05998是[M+H]+峰，在分辨率為30,000時高分辨質譜測得的質量誤差為1.0mg/kg，符合最新的歐盟(SANCO/10684/2009)化合物確證指令。碎片離子m/z156.01140、m/z108.04433、m/z92.04939和m/z65.03832是磺胺類化合物共有的特征碎片離子。碎片離子m/z156.01140是S-N鍵斷裂后，正電荷保留在含S端而形成的[C6H6NSO2]+；碎片離子m/z108.04433是離子[C6H6NSO2]+再失去一分子SO后產生的[C6H6NO]+；碎片離子m/z92.04939則是離子[C6H6NSO2]+失去一分子SO2產生的[C6H6N]+；碎片離子m/z65.03832則是離子[C6H6N]+裂解產生的[C5H5]+。除上述共有的特征碎片離子外，磺胺嘧啶還產生了其他豐度較高的碎片離子，這些碎片離子反應了R基的取代信息：離子碎片m/z96.05553是S-N鍵斷裂后失去C6H5NO2S，正電荷保留在含N端產生的[C4H6N3]+；離子碎片m/z158.00177是C-S鍵斷裂后，正電荷保留在含S端生成的[C4H4N3O2S]+；而離子碎片m/z185.08226則是S-N鍵和C-S鍵同時斷裂，失去HSO2，發生偶氮反應形成的[C10H9N4]+。推導裂解途徑如下(圖5)：

圖5 磺胺嘧啶的HCD質譜裂解途徑

當HCD和CID的碰撞能量均為55%時，CID裂解主要生成碎片離子m/z156.01160、m/z108.04440、m/z158.00204、m/z92.04945和m/z185.08234。推斷其裂解機理為：S-N鍵和C-S鍵同時斷裂，失去HSO2，發生偶氮反應形成[C10H9N4]+m/z185.08234；C-S鍵斷裂生成[C4H4N3O2S]+m/z158.00204；S-N鍵斷裂，生成[C6H6NSO2]+m/z156.01161；而碎片離子m/z156.01161失去一分子SO或SO2產生的[C6H6NO]+m/z108.04431和[C6H6N]+m/z92.04938。

HCD與CID相比(圖6)，具有共同的碎片離子峰m/z185.08217、m/z158.00187、m/z156.01138、m/z108.04439和m/z92.04948，都是在-SO2-基團兩端進行的裂解。除此之外，HCD還生成了m/z96.05553和m/z65.03838等離子。在相同碰撞能量的CID模式下未得到這些離子碎片，且HCD譜圖更為直觀清晰。

圖6 磺胺嘧啶在HCD(A)與CID(B)模式下的質譜圖比較(碰撞能量：55%eV)

3.4 磺胺甲基異噁唑

英文名稱：sulfamethoxazole

結構式：

分子量：253.05211，母離子：[M+H]+=254.05939

對[M+H]+進行二級質譜掃描(HCD)，m/z254.05916是[M+H]+峰，在分辨率為30,000時高分辨質譜測得的質量誤差為-0.90mg/kg，符合最新的歐盟(SANCO/10684/2009)化合物確證指令。碎片離子m/z156.01115、m/z108.04415、m/z92.04924和m/z65.03820是磺胺類化合物共有的特征碎片離子。碎片離子m/z156.01115是S-N鍵斷裂后，正電荷保留在含S端而形成的[C6H6NSO2]+；碎片離子m/z108.04415是離子[C6H6NSO2]+再失去一分子SO后產生的[C6H6NO]+；碎片離子m/z92.04924則是離子[C6H6NSO2]+失去一分子SO2產生的[C6H6N]+；碎片離子m/z65.03820則是離子[C6H6N]+裂解產生的[C5H5]+。除上述共有的特征碎片離子外，磺胺甲基異噁唑還產生碎片離子m/z99.05528，該碎片離子反應了R基的取代信息：是S-N鍵斷裂后失去C6H5NO2S，正電荷保留在含N端產生的[C5H8N3]+。推導裂解途徑如圖7。

圖7 磺胺甲基異噁唑的HCD質譜裂解途徑

當HCD和CID的碰撞能量均為55%時，CID裂解主要生成碎片離子m/z156.01122、m/z188.08170和m/z108.04417。推斷其裂解機理為：S-N鍵斷裂，生成[C6H6NSO2]+m/z156.01138；碎片離子m/z156.01161失去一分子SO產生的[C6H6NO]+m/z108.04424；S-N鍵和C-S鍵同時斷裂，失去HSO2，發生偶氮反應形成[C10H10N3O]+m/z188.08170。

HCD與CID相比(圖8)，具有共同的碎片離子峰m/z156.01138和m/z108.04439，都是在-SO2-基團兩端進行的裂解。除此之外，HCD還生成了m/z99.0552、m/z92.04924和m/z65.03820碎片離子。在相同碰撞能量的CID模式下，未得到該離子碎片。另外，CID還產生碎片離子m/z188.08170。(圖8)

3.5 磺胺噻唑

英文名稱：sulfathiazole

結構式：

分子量：255.01362，母離子：[M+H]+=256.02089

對[M+H]+進行二級質譜掃描(HCD)，m/z256.02075是[M+H]+峰，在分辨率為30,000時高分辨質譜測得的質量誤差為-0.55mg/kg，符合最新的歐盟(SANCO/10684/2009)化合物確證指令。碎片離子m/z156.01132、m/z108.04430、m/z92.04937和m/z65.03827是磺胺類化合物共有的特征碎片離子。碎片離子m/z156.01137是S-N鍵斷裂后，正電荷保留在含S端而形成的[C6H6NSO2]+；

圖8 磺胺甲基異噁唑在HCD(A)與CID(B)模式下的質譜圖比較(碰撞能量：55%eV)

碎片離子m/z108.04431是離子[C6H6NSO2]+再失去一分子SO后產生的[C6H6NO]+；碎片離子m/z92.04940則是離子[C6H6NSO2]+失去一分子SO2產生的[C6H6N]+；碎片離子m/z65.03831則是離子[C6H6N]+裂解產生的[C5H5]+。除上述共有的特征碎片離子外，磺胺甲基嘧啶還產生碎片離子m/z101.01657，該碎片離子反應了R基的取代信息：是S-N鍵斷裂后失去C6H5NO2S，正電荷保留在含N端產生的[C3H5N2S]+。推導裂解途徑如圖9。

當HCD和CID的碰撞能量均為55%時，CID裂解主要生成碎片離子m/z156.01157和m/z108.04424。推斷其裂解機理為：S-N鍵斷裂，生成[C6H6NSO2]+m/z156.01138；碎片離子m/z156.01161失去一分子SO產生[C6H6NO]+m/z108.04424。

圖9 磺胺噻唑的HCD質譜裂解途徑

HCD與CID相比(圖10)，具有共同的碎片離子峰m/z156.01138和m/z108.04439，都是在-SO2-基團兩端進行的裂解。除此之外，HCD還生成了m/z101.01657、m/z92.04937和m/z65.03827碎片離子。在相同碰撞能量的CID模式下，未得到該離子碎片，且HCD譜圖更為直觀清晰。

圖10 磺胺噻唑在HCD(A)與CID(B)模式下的質譜圖比較(碰撞能量：55%eV)

3.6 磺胺甲基嘧啶

英文名稱：sulfamerazine

結構式：

分子量：264.06810，母離子：[M+H]+=265.07537

對[M+H]+進行二級質譜掃描(HCD)，m/z265.07547是[M+H]+峰，在分辨率為30,000時高分辨質譜測得的質量誤差為0.39mg/kg，符合最新的歐盟(SANCO/10684/2009)化合物確證指令。碎片離子m/z156.01137、m/z108.04431、m/z92.04940和m/z65.03831是磺胺類化合物共有的特征碎片離子。碎片離子m/z156.01137是S-N鍵斷裂后，正電荷保留在含S端而形成的[C6H6NSO2]+；碎片離子m/z108.04431是離子[C6H6NSO2]+再失去一分子SO后產生的[C6H6NO]+；碎片離子m/z92.04940則是離子[C6H6NSO2]+失去一分子SO2產生的[C6H6N]+；碎片離子m/z65.03831則是離子[C6H6N]+裂解產生的[C5H5]+。除上述共有的特征碎片離子外，磺胺甲基嘧啶還產生了其他豐度較高的碎片離子，這些碎片離子反應了R基的取代信息：離子碎片m/z110.07117是S-N鍵斷裂后失去C6H5NO2S，正電荷保留在含N端產生的[C5H8N3]+；離子碎片m/z172.01747是C-S鍵斷裂后，正電荷保留在含S端生成的[C5H6N3O2S]+；而碎片離子m/z190.02812則是離子m/z172.01747經分子離子反應，加合一分子H2O后形成的[C5H6N3O2S·H2O]+。推導裂解途徑如圖11。

當HCD和CID的碰撞能量均為55%時，CID裂解主要生成碎片離子m/z156.01138、m/z172.01755、m/z190.02803、m/z110.07116、m/z108.04424和m/z92.04929。推斷其裂解機理為：C-S鍵斷裂生成[C5H6N3O2S]+m/z172.01755，再經分子離子反應，加合一分子H2O后形成離子[C5H6N3O2S·H2O]+m/z190.02803；S-N鍵斷裂，生成[C6H6NSO2]+m/z156.01138和[C5H8N3]+m/z110.07116；碎片離子m/z156.01161失去一分子SO或SO2產生的[C6H6NO]+m/z108.04424和 [C6H6N]+m/z92.04929。

圖11 磺胺甲基嘧啶的HCD質譜裂解途徑

HCD與CID相比(圖12)，具有共同的碎片離子峰m/z156.01138、m/z172.01752、m/z190.02809、m/z110.07127、m/z108.04439和m/z92.04948，都是在-SO2-基團兩端進行的裂解。除此之外，HCD還生成了m/z65.03831碎片離子，它是離子m/z92.04939裂解產生的[C5H5]+。在相同碰撞能量的CID模式下，未得到該離子碎片，且HCD譜圖更為直觀清晰。

圖12 磺胺甲基嘧啶在HCD(A)與CID(B)模式下的質譜圖比較(碰撞能量：55%eV)

4 結論

磺胺類藥物是一類傳統的合成抗菌藥物，因其具有對氨基苯磺酰胺結構，在ESI正離子模式中產生[M+H]+分子離子，在HCD裂解過程中以-SO2-NH-基團為中心，發生S-N鍵的斷裂，并伴隨著重排，產生特征離子m/z156.01138、m/z108.04439、m/z92.04948和m/z65.03858。另外磺胺類藥物還發生C-S鍵的斷裂。HCD二級質譜產生的特征碎片離子可作為磺胺類藥物的判斷依據，而通過R基團斷裂的碎片離子峰可以推測取代基的結構。與CID相比，HCD技術提供了穩定的高能裂解方式，并可改善CID裂解中產生的cut-off效應。HCD裂解模式結合高分辨質譜數據，為推測化合物結構、質譜裂解機理等提供更為詳實的裂解碎片信息，為化合物的確證提供可靠的理論依據。該質譜裂解規律可以應用于磺胺及其類似物的質譜分析，對磺胺及其類似物的快速篩選鑒別、定量分析和藥動學研究起到一定的參考作用。

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