葛根素標準樣品的研制

(1.北京市理化分析測試中心，有機材料檢測技術與質量評價北京市重點實驗室，北京市科學技術研究院分析測試技術重點實驗室，北京 100089；2.中國標準化研究院，北京 100191)

葛為多年生豆科纏繞藤本植物，側蔓和須根多，但塊根深生，呈紡錘形或長棒形，表皮為淡黃色，有皺褶，是主要食用和藥用部分。葛根為野葛(Pueraria Lobata(Willd.) Ohwi)或粉葛(P. thomsomi Benth)的干燥根，含有異黃酮類、三萜類、芳香類等活性成分。其中異黃酮類化合物是葛根的主要化學成分。葛根味甘、辛，性涼，歸肺、胃經，具有解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉等功效[1]，被廣泛用于保護心腦血管[2-4]、治療感冒[5]、Ⅱ型糖尿病[6]、腹瀉等中藥復方制劑中，用量極大，是制劑的重要成分。其中葛根素是葛屬植物的特有成分，亦是主要有效成分，具有擴張冠狀動脈血管，降低血脂，增強心肌收縮力，降低血壓，防治高血壓頭暈、頭痛、頸項疼痛[7-12]等功效。

市場上葛根相關的產品種類繁多，其中葛根素作為葛根主要的化學成分，其含量的檢測需要該標準樣品作為檢測對照；同時，在葛根相關活性研究和產品開發中，葛根素也是重要的研究對象，因此迫切需要開展該標準樣品的研制工作。本研究采用高速逆流色譜(high-speed countercurrent chromatography，HSCCC)技術制備葛根素，通過紫外吸收光譜(ultraviolet absorption spectrometry，UV)、紅外光譜(infrared spectroscopy，IR)、質譜(mass spectrometry，MS)和核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)波譜等方法進行結構鑒定，并開展均勻性檢驗、穩定性檢驗、定值研究，最終得到純度大于98%、擴展不確定度小于1%的葛根素標準樣品。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

KQ-250E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TBE-300B半制備型高速逆流色譜儀(上海同田生物技術有限公司)；LC-20高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；RE-2000旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；ALPHR1-2冷凍干燥機(德國Marin Christ公司)；Spectrum400傅立葉變換紅外-近紅外光譜儀(美國PerkinElmer公司)；1100 Series LC/MSD SL(美國Agilent公司)，超導核磁共振譜儀(德國Bruker公司)。

乙酸乙酯，甲醇，正丁醇(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；乙腈(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；葛根提取物(湖南長沙遠航生物制品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 葛根素樣品制備與分裝

HSCCC溶劑體系為乙酸乙酯∶正丁醇∶水(2∶1∶3，v/v)，轉速900 r/min，流速1.5 mL/min，分離溫度25℃，檢測波長254 nm。根據HSCCC圖譜收集目標化合物，旋轉蒸發去除溶劑，冷凍干燥后得到高純度葛根素樣品。

將葛根素樣品采用2 mL棕色樣品瓶進行分裝。分裝是在相對獨立和潔凈空間進行的，以每瓶10 mg分裝，用十萬分之一天平稱量，樣品共100 瓶，以1～100號計。分裝好的樣品瓶放在4℃冰箱中長期保存。

1.2.2 純度分析

配制濃度為0.5 mg/mL的葛根素樣品溶液，采用HPLC峰面積歸一法對葛根素進行純度分析。色譜柱為Wondasil C18(5 μm, 150×4.6 mm) ；流動相∶乙腈∶水=12∶88；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：254 nm；運行時間：30 min。

1.2.3 結構確證

采用UV、IR、MS、NMR進行結構確證。UV分析條件：甲醇作為溶劑，濃度為0.1 mg/mL，掃描范圍200～400 nm；IR分析條件：KBr壓片法，掃描范圍400～4000 cm-1。MS分析條件：正、負兩種離子模式，錐孔氣流速40 L/min，毛細管電壓3.0 kV，脫溶劑溫度320℃，質量掃描范圍m/z150～1000。NMR分析條件：溶劑為氘代丙酮加重水，采集13C-NMR和1H-NMR譜圖。

1.2.4 均勻性、穩定性、定值研究

依據GB/T 15000.3—2008《標準樣品工作導則(3)標準樣品：定值的一般原則和統計方法》[13]開展均勻性檢驗、穩定性檢驗、定值研究工作。均勻性：采用方差分析法進行純度均勻性檢驗，判斷葛根素的均勻性是否合格。穩定性：將葛根素樣品避光貯存于4℃，開展12個月長期穩定性的研究。采用直線作為經驗模型，觀察斜率值是否有顯著變化，預測葛根素的穩定性變化。定值：采用多個實驗室協作試驗的聯合定值方式，分別對隨機抽取8個樣品進行檢測，對所采集的測定結果采用格拉布斯(Grubbs)檢驗法進行檢驗，計算葛根素標準樣品的標準值和不確定度。

2 結果與分析

2.1 葛根素制備及純度分析

采用HSCCC乙酸乙酯∶正丁醇∶水(2∶1∶3，v/v)溶劑體系分離純化得到高純度葛根素樣品(圖1)，采用HPLC對葛根提取物和分離所得單體進行洗脫，254 nm檢測波長下，應用峰面積歸一法計算純度值，分離所得單體葛根素的純度為99.53%。(圖2)

圖1 葛根素HSCCC圖

圖2 葛根素HPLC圖A.葛根提取物；B.分離所得單體

2.2 結構確證

采用UV、 IR、 MS、NMR對葛根素進行結構鑒定。UV最大吸收波長為250 nm(圖3)； IR吸收峰(圖4)：3240(-O-H)，1634(-C=O)，1515，1446(Ar)，1260，1212，1178，1082(醚-C-O)。通過ESI-MS正負離子模式掃描(圖5)可得：[M+Na]+=439.2，[M-H]-=415.1，故測定的相對分子質量為416。1H-NMR和13C-NMR測試結果見圖6，通過對數據進行歸屬(表1、表2)。與文獻[14,15]進行比較，確定該樣品為葛根素。

圖3 葛根素紫外吸收光譜圖

圖4 葛根素紅外光譜圖

圖5 葛根素質譜圖A.正離子模式；B.負離子模式下

圖6 葛根素核磁共振圖譜A.1H-NMR；B. 13C-NMR

H的位置測定值文獻值[15]2832882857951798669997022ˊ73917403ˊ68226835ˊ68226836ˊ73917401ˊˊ4829490

表2 13C-NMR測試數據

續表2

2.3 均勻性檢驗

由于所制備的樣品單元數都小于100，根據隨機數表，分別抽取10瓶樣品進行均勻性檢驗。其中葛根素瓶號為42、9、67、89、53、63、32、75、36、60；每瓶樣品各稱3份，每份1.0 mg按照1.2.2純度分析方法進行HPLC分析，計算其純度。采用方差分析法進行檢驗，對其均勻性做出判斷。結果見表3。

表3 根素樣品均勻性檢驗結果

2.4 穩定性檢驗

將葛根素樣品于4℃冰箱冷藏避光保存，以1年為期，對制備的葛根素樣品每3個月取樣，按1.2.2純度分析方法，峰面積歸一化法進行純度計算，每份試樣平行測試3次，采用t檢驗對數據進行分析，穩定性檢驗結果見表4。

表4 穩定性檢驗結果

采用直線作為經驗模型，觀察斜率值是否有顯著變化，以此對標準樣品的穩定性變化進行預測。斜率可用下式計算：

直線上的點的標準偏差可由下式計算：

式中穩定性測量次數n=3。

取其平方根s=0.276%，與斜率相關的不確定度用下式計算：

自由度為n-2和p=0.95(95%置信水平)的分布t因子等于3.128，由于|b1|

2.5 定值

對聯合定值的8家實驗室所采集的測定結果，采用Grubbs檢驗法進行檢驗，未發現異常值。經過數據統計，計算得出葛根素樣品的標準值和不確定度。不同實驗室檢測和方差分析結果見表5、表6。

表5 不同實驗室檢測結果

表6 不同實驗室方差分析結果

總平均值由下式計算：

總平均值的不確定度等于：

=7.43×10-5,

式中，實驗室內測量次數n=6，實驗室數量p=8，

在置信概率為95% 時，k=2，則擴展不確定度UCRM=2uCRM=0.70%。

3 結論

針對我國尚無葛根素國家實物標準樣品的現狀，開展了葛根素標準樣品的研制工作，成功的建立了葛根素樣品的制備方法。并依據GB/T 15000標準樣品工作導則，對制備得到的葛根素樣品進行均勻性檢驗、穩定性檢驗及定值研究，最終申報獲批成為國家實物標準樣品。

葛根素標準樣品的標準值為99.51%，擴展不確定度(95%置信區間)為0.70%。該標準樣品符合GB/T 15000標準樣品工作導則要求，填補了國內該領域研究的空白。葛根素標準樣品不僅可以滿足葛根及相關產品分析檢測、質量控制工作的需求，同時，也為檢測結果的準確性、可比性，以及溯源性提供了技術支撐。

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