凍頂烏龍茶湯風味物質組分的電噴霧電離飛行時間質譜分析

(1.北京大學公共衛生學院,北京 100191；2.浙江大學信息與電子工程學院,杭州 310027；3.北京大學天然及仿生藥物國家重點實驗室,北京 100191；4.北京大學藥學院化學生物學系,北京 100191)

烏龍茶是一種幾世紀前起源于中國的半發酵茶葉飲品，并且越來越受到全世界消費者的青睞。烏龍茶的獨特品質主要在于它的半發酵加工工藝。凍頂烏龍茶產自臺灣南投縣，主要是以青心烏龍為原料制成的半發酵茶，是一種品質極高的烏龍茶，有“茶中圣品”之稱。

烏龍茶的品質主要通過香味、風味和外觀3個方面來進行評價，其中香味和風味是兩個最重要的評價指標。烏龍茶的香味主要由烏龍茶中揮發性的香味成分決定，包括脂類、醇類和醛酮類物質等。烏龍茶茶湯的風味主要由烏龍茶溶于水中的有機成分決定，烏龍茶的保存和沖泡方式也會對其風味造成一定的影響。烏龍茶茶湯中的多種風味成分決定了烏龍茶的營養價值，例如兒茶素的抗氧化和抗腫瘤功能[1]。茶多酚、氨基酸、可溶性多糖和咖啡堿是烏龍茶茶湯中最重要的營養和風味物質。其中茶多酚一直是人們研究的熱點，包括兒茶素類、黃酮類、酚酸類和花色素類等。烏龍茶中茶多酚中的主要組分是表沒食子兒茶酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素(EGC)和表兒茶素(EC)，占茶多酚總量的60%～80 %[2]。因此，本次對茶湯風味物質的研究將重點放在了茶多酚上。

目前針對茶湯營養成分的研究，主要采用高效液相色譜或和質譜聯用的方法：茶多酚測定參照GB—8313測定方法(分光光度法)[3]，兒茶素測定參照GB—8313(高效液相色譜法)[3]，游離氨基酸測定參照GB—8314測定方法(水合茚三酮比色法)[4]，咖啡堿測定參照GB—8312測定方法(高效液相色譜法、紫外分光光度法)[5]。因為茶湯含有復雜的混合組分，其物質種類遠超過人們的想象，因此，針對茶湯風味物質的研究通常需要色譜的參與，從而使得這些物質得到分離和鑒定。面對混合物的質譜，研究者沒有標準譜庫的參考，單從質譜圖的角度出發，研究者通常很難得到非常有效的結果和結論。目前針對混合物質譜檢索方法的研究有很多，本研究也希望在這一方面做出自己的嘗試。

研究嘗試建立一套較為系統的、針對小分子量(600D以下)混合物質譜的快速定性分析方法。該方法以分子質譜的質荷比和同位素峰強度比為基礎，利用計算機強大的計算功能，對自建化學品數據庫進行檢索，從而實現對質譜峰的定性解釋。該方法毋需借助色譜或二級質譜，且對使用者的化學知識要求不高。當然，其準確性和普遍的適用性仍有待進一步實驗證實。

1 實驗方法

1.1 茶湯準備

本實驗茶葉樣本為產自臺灣南投縣鹿谷鄉的凍頂烏龍茶。實驗前，茶葉密封保存在4℃冰箱中。用分析天平稱取0.3780±0.0016g茶葉6份。將超純水加熱到指定溫度，分別將茶葉(各3份平行樣)與加熱到85℃和100℃的超純水(電導率：14.30MΩ)各50.0mL混合得到茶湯，此過程模擬生活中沖茶的步驟。將茶湯在室溫下冷卻，冷卻30min后接近室溫時通過0.45μm的濾膜過濾得到所需的茶湯樣品。

1.2 質譜條件

質譜測定使用Waters 公司 Xevo G2 Q-TOF 四極桿飛行時間質譜儀，電噴霧離子源(ESI)，ES+和ES-兩種模式對樣品中化合物進行電離。

茶湯水溶液直接進樣，每次進樣量0.2μL。

ES+模式：噴霧電壓為3.05kV；源溫度100℃；脫溶劑氣溫度299℃；氣簾氣流量50L/h；脫溶劑氣流量595L/h。

ES-模式：噴霧電壓為-2.08kV；源溫度100℃；脫溶劑氣溫度299℃；氣簾氣流量49L/h；脫溶劑氣流量596L/h。

1.3 混合物的質譜分析方法

電噴霧電離(ESI)作為一種軟電離技術，一般得到的都是樣品組分中的分子離子，即一般是單電荷離子。因此，可以假定我們所關心的質譜峰皆為分子離子峰。

在沒有色譜分離和標準物質參考的條件下，想要對混合物質譜進行解析是非常困難的，需要非常豐富的分析化學和有機化學知識。對于像茶湯這樣非常復雜的混合物，僅靠簡單的人工分析數據幾乎不可能完成對于質譜峰的指認。因此，需要借助計算機和其他研究者的研究成果。各種烏龍茶茶湯中的風味成分大多是共有的，如果大量地檢索烏龍茶相關研究文獻，從文獻中找到這些物質成分的質譜信息或同位素豐度得來的化學計量信息，再與實驗所得到的混合物高分辨質譜數據進行比對，理論上就可以對某些數據吻合的質譜峰作出定性的解釋，當然這種解釋只能精確到分子式，對于每種分子式所對應的大量異構體，也只能參考文獻進行解釋。此外，對于通過質譜質量進行檢索得到的結果，也通過同位素峰強度比和二級質譜的數據進行驗證。由于數據庫的來源為既往的文獻研究，因此，檢索結果也可以通過既往文獻得到驗證。本次試驗采用了圖1所示的混合物質譜解析策略。

1.3.1 化學品庫的建立

在ScienceDirect數據庫中檢索“Oolong”和“MS”兩個關鍵詞，按關聯度排序。對所得到的文獻選取前50篇，通過全文的瀏覽分析，來選取合適的入庫文獻。文獻選取的標準：

圖1 混合物質譜解析策略

1)必須是針對烏龍茶茶湯風味物質的質譜研究或液質聯用研究；

2)研究必須報告分離鑒定出物質的質譜信息，包括以下但并不是全部數據：該物質的精確分子量、[M+H]+或[M-H]-模式下質譜信息、分子式、化學名、相對誤差等。

得到入庫文獻后，將各物質的質譜信息錄入到Microsoft Office Excel 2010中，建立數據庫。數據庫中包含的信息有化學名、分子式、精確分子量、[M+H]+、[M+Na]+和[M-H]-模式下的質譜峰的質荷比，如果原文獻有二級質譜信息，則包含二級質譜信息。最后按照精確分子量大小進行排序，化學品庫建立完畢。

1.3.2 化學品庫的檢索

對每個測得的質譜峰(同位素峰除外，是否同位素峰通過觀察質譜圖得出)的質荷比在化學品庫中進行遍歷。分別尋找在[M+H]+、[M+Na]+和[M-H]-3種模式下與之匹配的分子式，如果ES+質譜峰的質荷比與某種物質的[M+H]+和[M+Na]+精確分子量相對誤差小于0.0003%[6]，則認為該物質所對應的分子式可能屬于該質譜峰。如果有超過一種分子式對應的加氫或加納質量誤差小于0.0003%，將這些分子式都記錄下來。同理，ES-模式下的質譜峰則與[M-H]-的質量進行比較。所有質量數據均保留到小數點后4位。

如果只有一種分子式對應該質譜峰，我們認為該分子式就是質譜峰的合理解釋，而該分子式對應化學品庫的物質，就是可能的被鑒定物質。

檢索過程通過計算機編程實現，編程環境為Windows R x64 3.22。

1.3.3 分子式的驗證

由于茶多酚、咖啡因、茶多糖等物質大多只含有C、H、O、N 4種元素，少量物質會含有P、S等元素以及一些金屬元素。因此，此項研究中假設各質譜峰對應化合物只含C、H、O、N 4種元素。

基于上述假設，可以認為某質譜峰的質荷比所對應的分子式是由C、H、O、N 4種元素組合構成。將上一步所有能夠在化學品庫中得到匹配的質譜峰都帶入這一步，驗證是否有其他合理的分子式可以滿足質譜峰的質量要求。質量要求仍然是誤差小于0.0003%。

1.3.4 同位素峰強度比進行驗證

質譜上分子離子峰理論質荷比，是按照豐度最高的同位素的精確分子量計算的。由于每種元素都存在同位素，因此，在譜圖中出現了同位素異構體峰，同位素異構體峰的強度是根據各種同位素在自然界中的豐度確定的。對于只含有C、H、O、N 4種元素的物質來說其同位素峰強度比可以用下式表示，w、x、y、z分別為分子式中C、H、O、N 4種元素的化學計量數。

峰強度比的大小主要由C元素的個數來決定的，因此，在知道峰強度比的情況下可以計算出C元素的個數。在本研究中假定計算出C元素個數與相應檢索得分子式中C元素個數相差小于等于2的話，該分子式的推測就是合理的。

1.3.5 二級質譜進行驗證

如果在自編入庫的文獻中含有化學物質的二級質譜信息，就可以通過檢索這些二級質譜對應的質譜峰，在我們所得的質譜圖中是否出現，來驗證該種化學物質是不是質譜峰的合理解釋。我們知道，某種物質的二級質譜是相對特異的，因此可以用于對同一分子式不同物質的排除。

1.4 質譜圖的比較以及實驗可重復性評價

為了評價本套實驗方法的可重復性，采用cosine相似度對平行樣本的質譜圖進行比較。選取峰強度最大的10個峰參與比較。假設兩個質譜圖的信號分別為X= (x1,x2,…,x10)和Y=(y1,y2,…,y10)，X和Y包含了質荷比信息和峰強度信息。使用如下公式計算相似度SC[23]：

因為X中既包含質荷比信息又包含峰強度信息，因此對X和Y的定義如下：

質荷比為m，而峰強度比為x，參考既往文獻，確定了峰強度和質荷比在這個公式中所占的權重，即a=0.5，b=1[7]。

2 結果

2.1 化學品庫

在ScienceDirect數據庫中檢索關鍵詞“Oolong”、“MS”共得到963篇文獻，按照關聯程度排序，選取其中與檢索內容相關度最高的前50篇文獻。通過人工瀏覽，從50篇文獻中篩選得到14篇與本次研究內容相關的文獻。其中大多數文獻重點針對烏龍茶中的兒茶素類和黃酮類化合物進行了研究[8-15]，一篇文獻針以烏龍茶中的氨基酸為研究重點[16]，部分文獻則是對烏龍茶的多糖類物質進行了研究[17-21]。根據檢索出的物質建立化學品庫，所得物質共208種，精確分子質量在32.0262到898.1956之間。該化學品庫中的物質涵蓋了有機化學分類中的醇類、醛類、酸類、烷烴類等，并且包括兒茶素及其衍生物、黃酮類化合物、茶多糖、咖啡因等對茶湯的風味和營養價值影響最大的化合物。

2.2 85℃和100℃茶湯質譜測定結果

85℃和100℃沖泡所得到的茶湯分別在ES+和ES-模式下電離進行質譜分析，各重復3次共得到12張質譜圖。為了簡化處理，也為了避免噪音基線的干擾，選取了相對峰強度在前100的質譜峰，并且認為這些質譜峰所對應的化合物可能對茶湯的風味和營養價值有更大的貢獻。我們希望比較85℃茶湯和100℃茶湯中所含風味營養物質的差別。

圖2為85℃和100℃一組平行樣在ES+和ES-模式下所得到的質譜圖。

2.3 質譜峰的指認

如前述的方法，將質譜測定的結果帶入到化學品庫中進行檢索，尋找與質譜峰質荷比相差小于0.0003%的物質。檢索分為以下3種情況：

(1)[M+H]+的精確分子量與正離子質譜的結果進行比較；

(2)[M+Na]+的精確分子量與正離子質譜的結果進行比較；

(3)[M-H]-的精確分子量與負離子質譜的結果進行比較。

對正離子質譜圖的5個質譜峰和負離子質譜圖的12 個質譜峰做出了可能的解釋。沒有在[M+H]+模式下找到與化學品庫匹配的結果。在[M+Na]+模式下5個質譜峰329.0643、365.1060、481.0747、633.1214、779.2018在化學品庫找到了與之匹配的分子式，并且在化學品庫中有且僅有一種分子式與相應的質譜峰對應。對應的物質共9種,其中同樣的分子式可能對應不同的化合物(表1)。

對于負離子質譜圖的檢索，得到了更為豐富的結果。共有12個質譜峰在化學品庫中找到了與之匹配的分子式, 并且每個質譜峰只找到了一種分子式與之對應。而找到對應的化學物質共有22種。大多數得到匹配的質譜峰，同時出現在85℃和100℃的實驗組茶湯質譜中(表2)。

結合正負離子質譜的結果，共找到26種物質對17個質譜峰進行解釋。兒茶素、表兒茶素、蔗糖以及兒茶素沒食子酸酯，表兒茶素沒食子酸酯，所對應的質譜峰分別出現在正負離子質譜圖中。在這26種物質中絕大多數為兒茶素類和黃酮類物質，只有焦谷氨酸、奎寧酸、蔗糖3種物質非兒茶素和黃酮類化合物。非常遺憾的是，在正負離子模式的質譜圖中，都沒有找到咖啡因可能對應的質譜峰，而根據既往的研究和我們的經驗，咖啡因在紅茶和烏龍茶中的含量應該較高。我們認為在正離子質譜圖中的m/z195質譜峰很有可能是咖啡因，但它的相對誤差是0.0004%。因為本實驗精度的要求，無法確認195質譜峰為咖啡因。

圖2 85℃(a,b)和100℃(c,d)茶湯ES+、ES-模式質譜圖

85℃100℃測量值(m/z)理論值誤差(%)分子式對應化合物+-329064332906370．0002C15H14O7沒食子酸兒茶素表沒食子酸兒茶素+-365106036510600．0000C12H22O11蔗糖+-481075448107470．0002C22H18O11沒食子兒茶素沒食子酸酯表沒食子兒茶素沒食子酸酯-+633121463312200．0002C30H26O14棓兒茶酸二聚體+-779201877920110．0001C33H40O20山奈酚?3?氧?葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷槲皮素?3?氧?二鼠李糖葡萄糖苷山奈酚?3?氧?葡萄糖蕓香糖苷

ES+模式下[M+Na]+Na 原子精確質量=22.98977，+表示檢出，-表示未檢出

表2 ES-模式下指認物質

ES-模式下(M-H) H 原子精確質量=1.007825，+表示檢出，-表示未檢出

2.4 對指認結果的驗證

由于物質指認方法僅根據分子式的精確分子量得出，因此存在一定的局限性，可能出現遺漏或指認錯誤，因此，實驗采用了3種方法對指認分子式的唯一性以及合理性進行驗證。

2.4.1 分子式的唯一性

對于具有同一精確分子量，可能存在多種分子式，也就是元素的隨機組合形式與之對應。因此，首先需要驗證該分子量的分子式僅對應于所找到的分子式，并不存在其他可能的元素組合形式。通過驗證可以發現在分子量較小(<600D)的情況下，精確分子量與分子式基本上滿足意義對應的關系(表3)。

表3 分子量400D以下元素隨機組合驗證結果

續表3

注：灰色底紋表示該組合與化學品庫中分子式匹配；深灰色底紋表示該分子式對應物質存在，但不在化學品庫中；白色底紋表示該種組合的分子式不存在；*表示該種分子式對應物質不穩定。

2.4.2 同位素峰強度比驗證分子式

通過同位素峰強度比，計算分子式中的C元素化學計量數，并與化學品庫中尋找到的分子式進行比較。負離子質譜圖中的質譜峰128、191、305、341、457、463，755、771對應的同位素峰強度比結果與通過分子量檢索所得結果較為一致(表4)。

表4 負離子模式下同位素峰強度比驗證表

2.4.3 二級質譜信息驗證分子式

二級質譜可以給我們的分子式提供更為詳細的信息，然而遺憾的是，文獻中所提供的二次質譜的質荷比信息，只精確到了整數，無法與實驗所得的質譜圖進行精確的比較。

最終，對負離子模式下的12個質譜峰進行檢驗，除593質譜峰外，其余質譜峰都得到了至少一種方法的驗證。

2.5 實驗結果的可重復性

通過比較組內相似度來驗證該質譜方法的可重復性。組內和組間相似度基本上在80%到90%之間(表5)。組內的相似度所得到的結果并不是十分理想，可能源于茶湯本身并不穩定，也可能由于在茶湯制備和上樣的操作難以按照完全一致的規范控制所致。

表5 組內相似度 請按示意排表

注：S1-S2表示組內平行1和平行2間的相似度

3 討論與結論

3.1 凍頂烏龍茶質譜解析

分別在正負兩種離子模式下對凍頂烏龍茶茶湯進行了質譜分析，正離子模式下有5個峰得出了唯一的分子式解釋，負離子模式下有12個峰得出了唯一的分子式解釋。其中幾乎所有的分子式都得到了一種或兩種方法的驗證。只有質譜峰m/z593所對應的分子式沒有得到任何一種方法的驗證。在做出解釋的質譜峰中，其相對峰強度大多較高，對應的物質主要為兒茶素和黃酮類物質。可以粗略地認為，凍頂烏龍茶中兒茶素類和黃酮類物質含量較高，此結果與既往的文獻研究結果是一致的[8-23]。

既往文獻中，大多數研究者對于茶湯的質譜分析都采用了負離子質譜圖[8-23]，結合我們的結果可以看出，負離子質譜應該更適合于烏龍茶茶湯的質譜分析。

3.2 混合物的質譜解析方法

本研究所建立的混合物質譜的分析方法，借助計算機的幫助，以質荷比為檢索基礎，適合于較小分子量的化合物分子式分析(<600D)。結合同位素峰強度比和元素隨機組合的驗證方法，可以保證所得結果在一定程度上的準確性。但因為缺少對照試驗，無法進行更進一步的分析。在重復性方面，雖然質譜在峰強度方面的重復性存在著一定的缺陷，但對整體的檢索工作并沒有造成實質性的影響，該方法的重復性還是有非常好的保障。

研究之初曾提出了兩種分析策略。第一種分析策略直接從化學品庫中尋找質譜峰對應的分子式；第二種策略先得出每種質荷比的所有分子式組合，再從化學品庫中尋找相應的分子式與化合物。兩種方法的本質是相同的，但第一種更適合于快速而簡單地分析，尤其是在化學品庫較小的情況下。而第二種策略則更為完善，但對化學品庫有較高的要求。當只對某個分子離子峰感興趣時，第二種分析策略是一個非常好的選擇。

3.3 方法的局限性

化學品庫是影響工作質量的一個重要因素，它直接限制了所能找到的化合物的種類，同時也可能對分析工作帶來較大的偏倚。研究在之后的工作中也進一步完善了化學品庫，建立更全面、更準確和更少偏倚的化學品庫，擴增使用了REAXYS數據庫，該數據庫含有大量天然產物的化學組分信息。在nature product目錄下檢索“tea”得到539個結果，來自于69349篇文獻。批量導出后，經過人工篩選，總共將461種化合物納入了本研究的化學品庫。

本次實驗的局限性還包括：缺乏其他標準方法的比照，質譜圖無法進行絕對的定量分析，重復平行試驗太少。只能為質譜峰找到對應的分子式，很難從質譜結果中得到所含物質的結構式，只能通過與既往文獻的比較，對分子離子峰對應的化合物進行合理的推測。當然，在特定的研究領域，這方面的缺陷可以得到一定程度的彌補。

在本項研究中，建立了一套針對復雜混合物質譜的分析策略，并用該策略嘗試了對凍頂烏龍茶茶湯風味成分的分析。為17個質譜峰尋找到可能對應的分子式與化合物，其中大多數化合物為兒茶素和黃酮類物質。最后對方法的可重復性進行了檢驗,此方法對于混合物質譜的初步解析將會有一定的應用參考價值。

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