兒童原發性EB病毒感染caspase-3/6水平與肝損害的相關性研究

溫正旺　陳益平　徐志偉　石海礬　狄軍波　陳均亞　陳潔　蔡曉紅

325000 溫州醫科大學附屬第二醫院兒童感染科(溫正旺、陳益平、徐志偉、石海礬、狄軍波、陳均亞、陳潔)，兒童呼吸科(蔡曉紅)

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是非嗜肝病毒感染引起兒童肝損害的常見病原體，原發性急性EBV感染可導致82%的患兒出現肝功能損傷[1]，大部分患兒的癥狀會在治療1周內減退[2]。目前對EBV感染導致肝功能損傷的機制尚未完全明確。探索EBV感染后機體內與肝功能損害分子的表達情況，將為EBV感染導致肝功能損傷的防治提供新的思路和策略，有助于闡明EBV感染誘導肝功能損傷的內在分子機制。Caspase3/6是導致肝細胞凋亡的主要分子蛋白，但是否與原發性EBV感染導致的肝功能損傷存在相關性，目前尚未明確。本研究通過收集患兒肝功能數據，并采用ELISA法檢測患兒血液中肝細胞損傷相關分子蛋白的表達，探索原發性EBV感染肝功能損害與caspase3/6表達變化的相關性及其臨床意義。

1　材料與方法

1.1研究對象收集2016年7月至2017年6月在溫州醫科大學附屬第二醫院住院治療的原發性EBV感染患兒249例，EBV-IgM檢測都為陽性，其中伴有肝功能損傷的168例為肝功能異常組，分別檢測其急性期及恢復期實驗室指標，恢復期抽血時間為住院治療第7天，肝功能正常的81例為肝功能正常組，年齡都在1周歲到14周歲之間；肝功能異常組按年齡再分為4個亞組，包括幼兒組(1到3周歲)37例、學齡前組(3周歲到7周歲)50例、學齡組(7周歲到10周歲)36例、青少年組(10周歲到14周歲)45例。收集相關的肝功能數據：AST、ALT、GGT、TBLL、DBLL。標本采集獲得患者或家屬知情同意，本研究通過溫州醫科大學附屬第二醫院倫理委員會審核同意。

1.2ELISA方法檢測血清caspase-3和caspase-6蛋白的表達水平Caspase-3和caspase-6 ELISA試劑盒為美國PeproTech公司生產；抗Caspase-3和caspase-6抗體購自英國abcom公司。取caspase-3和caspase-6酶聯免疫試劑盒，室溫下靜置30 min，每孔加50 μl標準樣品或待測樣品，留兩孔為空白對照孔；塑料薄膜覆蓋微孔板，孵育2 h；洗板4次，反轉酶標板，拍干各孔剩余的洗滌液；每孔加50 μl生物素標記的抗caspase-3和caspase-6抗體，塑料膜封板，孵育2 h；洗板4次，反轉酶標板，拍干各孔剩余的洗滌液；每孔依次序加入顯色劑A和B，避光室溫孵育30 min；加入反應終止液100 μl，自動酶標儀于 450 nm處測定各孔的光密度(optical density，OD)值；以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，根據樣品所測OD值確定其濃度。

2　結果

2.1肝功能異常組急性期和恢復期各項肝功能指標比較肝功能異常組中急性期和恢復期進行比較ALT差異具有顯著性(F=122.4，P<0.001)，其余差異均無統計學意義(見表1)。

2.2肝功能異常組中各年齡分組間ALT差異比較

肝功能異常組按年齡分為4個亞組，其中僅青少年組ALT與其他各組比較差異具有統計學意義(F=143.4，P<0.001)，余指標在各組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

2.3肝功能異常組和肝功能正常組間caspase-3/6比較以及肝功能異常組急性期和恢復期caspase-3/6比較肝功能異常組caspase-3和caspase-6的表達水平明顯高于肝功能正常組，差異具有統計學意義(F=153.4,P<0.001,F=210.1，P<0.001)(見表3)。肝功能異常組中急性期caspase-3和caspase-6的表達水平明顯高于恢復期，差異具有統計學意義(F=133.7,P<0.001,F=160.6，P<0.001)(見表3)。

2.4肝功能異常組中各年齡組間caspase-3/6比較肝功能異常組中按年齡分4個亞組，只有青少年組的caspase-3和caspase-6與其他組的比較差異具有統計學意義(F=152.1,P<0.001；F=122.9，P<0.001),余各組之間的caspase-3和caspase-6兩兩比較差異無統計學意義(P>0.05)(見表4)。

表1　肝功能異常組中急性期與恢復期ALT、AST、TBLL、GGT和DBLL的統計比較

表2　肝功能異常組中幼兒組、學齡前組、學齡組和青少年ALT、AST、TBLL、GGT和DBLL的統計比較

注：青少年組#P<0.05vs 幼兒組;*P<0.05vs 學齡前組;▲P<0.05vs 學齡期;其余P>0.05

Note:#P<0.05 adolescent group vs. young clindren group;*P<0.05 adolescent group vs. preschool group;△P<0.05 adolescent group vs. shcool age goup;P>0.05 for all the other comparisons

表3　肝功能異常組中caspase-3和caspase-6的表達水平的比較和急性期caspase-3和caspase-6的表達水平比較

2.5肝功能異常組急性期和恢復期caspase-3/6與ALT相關性分析肝功能異常組中急性期caspase-3和caspase-6的表達水平與ALT存在線性相關(r=0.982，P<0.001，r=0.965，P<0.001)(見圖1)。

3　討論

EBV屬于皰疹病毒4型，是臨床上導致兒童肝功能損傷的常見非嗜肝病毒。肝功能損害是原發性EBV感染最常見的并發癥，但EBV感染如何誘導肝功能的損傷，其分子機制目前尚未完全明確。最近的國內研究提示EBV感染與乙型肝炎病毒感染導致的肝功能損傷存在相似性甚至可能通過B淋巴細胞群存在協同作用[3]；Zekri[4]在研究丙肝患者時發現，如果合并有EBV活動性感染，患者的病情會更重，肝功能呈現進行性升高；在2000年甚至更早已有研究提示EBV感染可以通過誘發與機體免疫能力相關的因子從而導致機體各臟器功能的損傷，臟器的損傷主要表現為細胞的凋亡[5]。

表4　肝功能異常組中幼兒組、學齡前組、學齡組和青少年caspase-3和caspase-6的表達水平比較

注：青少年組#P<0.001vs 幼兒組;*P<0.001vs 學齡前組;▲P<0.001 vs 學齡期；余P>0.05

Notes.#P<0.001 adolescent group vs. young children group;*P<0.001 adolescent group vs. preschool group;▲P<0.001 adolescent group vs. school age group;P>0.05 for all the other comparisons

圖1　肝功能異常組急性期ALT與caspase-3/6的相關性分析Fig.1　The analysis of correlation between ALT and caspase-3/6 of liver fonction abnormal group

Caspase-6與caspase-3是細胞凋亡發生發展的關鍵分子，是絕大多數凋亡信號通路的共同調節因子，將胞外凋亡刺激轉化成胞內凋亡級聯反應，通常以酶原無活性的形式存在，在受到相關凋亡信號刺激后會被激活，通過降解蛋白分子的底物,從而誘導細胞凋亡；其中caspase-3還能通過水解胞內的細胞生存蛋白，進而誘導細胞的凋亡。動物研究文獻提示肝炎患者中的肝細胞損傷多數表現為凋亡形式，且和caspase系列分子依賴的肝細胞凋亡密切相關，其中 caspase-3和caspase-6作用最為明顯[6]，如甲肝、乙肝的患者血清中caspase-3/6的表達水平明顯升高[7-8]，Masuoka[9]甚至通過caspase抑制劑來治療丙肝并取得一定臨床效果，在丙型肝炎肝功能損傷的機制研究中還發現caspase-6可以誘導JNK(c-Jun氨基末端激酶,c-Jun N-terminal kinase)的激活從而導致肝功能損傷[10]；但caspase3/6與EBV感染導致的肝功能損害是否存在相關性，目前尚未明確。

本研究發現，原發性EBV感染患兒血清中 caspase-3和caspase-6的表達水平明顯上升，且肝功能異常組中ALT、caspase-3和caspase-6的表達水平明顯高于肝功能正常組。既往在對丙肝的研究提示，肝炎患者中caspase-3和caspase-6表達水平的上升可直接誘導細胞的凋亡，導致肝功能的損傷，而采用caspase的抑制劑后，caspase-3和caspase-6表達下降，部分患者肝功能恢復正常。在肝功能異常組患兒中，急性期患兒的caspase-3/6以及ALT表達水平明顯高于恢復期患兒，通過相關性分析發現當EBV感染后，急性期caspase3/6的表達與ALT的升高存在線性相關，提示原發性EBV感染所致肝功能的損傷與caspase3/6之間存在密切的內部聯系。同時根據年齡分組，青少年組的caspase-3、caspase-6以及ALT表達水平明顯高于其他3組，與中國香港兒童EBV感染導致肝功能損傷的研究中發現的隨著年齡的增長肝功能的損害越明顯的結果一致[11]。

因此，caspase-3/6的高表達與兒童原發性EBV感染所致的肝功能損害存在密切相關，同時ALT的升高與caspase-3/6的表達水平存在線性相關。

利益沖突:無

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