泛素蛋白酶體途徑和泛素羧基末端水解酶-3及其參與調節生物進程的研究進展

任國婧，師永紅 ，2

（1.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010110；2.內蒙古醫科大學附屬醫院病理科，內蒙古 呼和浩特 010050）

泛素是一個有大約8 KD分子量的小蛋白，其與靶蛋白的特異性結合稱為泛素化作用。泛素化是轉錄后的編輯，參與細胞的各種生物進程，蛋白的泛素化和去泛素化的過程在多種疾病的發生過程起重要作用包括信號轉導和維持蛋白的穩定、細胞的生長、分化、凋亡等并參與腫瘤的形成演進[1]。泛素蛋白酶體系統（UPS）作為蛋白降解的途徑，對依賴此途徑降解的蛋白具有高度選擇性，泛素化的異常蛋白質和短壽蛋白質能被26S蛋白酶體識別并降解[2]。此途徑又稱ATP-依賴降解途徑在細胞周期、DNA復制、免疫應答等生物過程中扮演重要角色。去泛素化酶（DUBs）可以逆轉蛋白的泛素化，將蛋白從泛素分子上分離開來，可以避免蛋白的過度降解并重新釋放出泛素單體，使泛素重新進入泛素蛋白酶體的循環[3]，對于調節生物體內蛋白的平衡起重要作用。

1 泛素與蛋白酶體降解體系

1.1 泛素與泛素化過程 泛素分子是存在真核生物細胞中由76個氨基酸分子組成的一個有大約8 KD分子量的小蛋白。泛素分子的主要特征是其含有的7種甘氨酸（Lys）殘基（Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48和Lys63）均能被泛素化產生相應的泛素與異肽鏈接的環狀鏈；當泛素被連接到第二個泛素的氮-末端時，產生了第八種鏈型即蛋氨酸1-鏈（Met-1）或“線性”鏈。同時，泛素也可以在甘氨酸（Lys）殘基上被乙?；蛘咴诮z氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）或酪氨酸（Tyr）殘基上磷酸化[4]，泛素分子每一個修飾都有可能極大地改變生物信號輸出結果。泛素與靶蛋白的特異性結合稱為泛素化作用。泛素化的編輯大體分為三個過程，首先是泛素分子被泛素激活酶E1激活，此過程需要分解ATP提供能量；其次有活性的泛素分子與泛素結合酶E2結合，最后在泛素蛋白連接酶E3的作用下將靶蛋白與E2s結合的泛素羧基末端連接，使靶蛋白被泛素-蛋白酶體識別并降解，其中決定蛋白特異性結合的酶是E3s[5]。一種蛋白質的降解需多次泛素化反應，形成泛素化鏈。蛋白的泛素化是一種動態的多層次的轉錄后的編輯，幾乎涉及真核生物的所有生物行為，包括生物信號轉導、細胞周期、細胞凋亡和腫瘤的形成與演進等。

1.2 泛素化與蛋白酶體降解體系 在真核細胞中蛋白質的降解有兩條重要的途徑，一條途徑是降解細胞外來的蛋白質、膜蛋白和細胞內長壽蛋白的溶酶體或者液泡自噬，其對蛋白的特異性較差，其他細胞內的物質如核酸、脂質和碳水化合物等均可通過此途徑被人體消化；另一條途徑是通過蛋白酶體途徑來降解異常蛋白質和短壽蛋白質，此途徑對要降解的目標蛋白有較高的選擇性，其對蛋白的降解是通過泛素化編輯作用來進行的[6]。蛋白酶體是26 S的蛋白質復合物，主要由20 S的核心顆粒和19 S或11 S的調節顆粒組成。核心顆粒是由2個α外環和2個β內環組成，每個環又由7個亞基構成。核心顆粒的α環在氮-端的中心軸形成一扇門以阻擋分子進入核心顆粒內。核心顆粒是蛋白酶體的水解核心，活性位點位于2個β環上，其中β1、β2和β5亞基具有蛋白酶活性，可分別裂解含半胱氨酸的天冬氨酸特異性酶活性、胰蛋白酶相似活性、糜蛋白酶活性的底物，催化不同的蛋白質降解。調節顆粒位于核心顆粒的兩端，形成空心圓柱的蓋子，其能識別，結合待降解的泛素化蛋白并與蛋白質的去折疊及使蛋白質定位于20 S的核心顆粒有關[7]。泛素化的蛋白質被26 S的泛素蛋白酶體識別并在泛素蛋白酶體降解，產生一些約7～9個氨基酸殘基組成的肽鏈，肽鏈進一步水解生成氨基酸殘基。

1.3 泛素化降解的底物蛋白及參與的生物過程 UPS是具有高度選擇性的蛋白降解系統，許多基因的蛋白均通過此途徑降解，影響生物的進程。巨噬細胞活化因子c（c-Maf）的過表達被認為是多發性骨髓瘤的顯著標志，在多發性骨髓瘤中c-Maf蛋白的水平顯著下降且出現骨髓瘤細胞凋亡，近期研究發現泛素連接酶UBE2O能下調c-Maf的活性及細胞周期蛋白D2的表達，恢復細胞中UBE2O活性其能與c-Maf形成Lys48-多聚泛素化鏈（K48）并使c-Maf降解，誘導多發性骨髓瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞生長[8]。清道夫受體B型1（SR-B1）屬于巨噬細胞受體的一種，在細胞的新陳代謝中有多重作用，包括促進度脂蛋白膽固醇脂（HDL-CE）選擇性分解、調節高密度脂蛋白的代謝、抗炎作用，還能促進維生素分子、病毒及凋亡細胞的吸收分解。SR-B1通過蛋白酶體途徑降解，NHERF1（Na+/H+exchanger regulatory factor-1）和NHERF2（Na+/H+exchanger regulatory factor-2）能分別促進SR-B1的甘氨酸-508和甘氨酸-500位點的泛素化促使其被泛素蛋白酶體識別并降解，減少SR-B1蛋白的水平，抑制SR-B1的作用[9]，增加疾病的風險。作為一種翻譯后編輯，泛素化的蛋白在炎性細胞中有重要作用。絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）亞家族p38α介導炎癥、凋亡等應激反應，成為開發抗炎藥物的靶位。Nedd4屬于泛素蛋白連接酶E3家族，有E3的活性特點，研究表明沉默Nedd4的表達或者敲除Nedd4的基因，細胞中磷酸化的p38水平增高，磷酸化的p38α（p-p38α）在p38α和Nedd4之間的泛素連接尤其是以甘氨酸-48鏈（K-48）的多聚泛素化連接中有重要作用，能促進p38α亞型（p38αV1和p38αV2）降解。同樣p38和Nedd4的K-48和K-63連接也能誘導p-p38α通過蛋白酶和溶酶體途徑的降解。Nedd4還可以通過調節p-p38α的降解抑制腫瘤壞死因子α（TNF-α）和激活蛋白-1（AP-1）的活性，為炎癥的靶向治療提供更多的方向[10]。透明質酸酶配體（PCB-126）能增加腫瘤抑制基因（P53）的泛素化及其通過泛素蛋白酶體降解過程來抑制P53的表達，減少游離泛素單體，擾亂泛素蛋白酶體降解平衡，為腫瘤的治療提供可能靶點[11]。

2 去泛素化酶體系的作用

2.1 去泛素化酶家族及作用機理 去泛素化酶可以逆轉蛋白的泛素化，將蛋白從泛素分子上分離開來，并重新釋放出泛素單體，使之進入泛素蛋白酶體的循環。依據基因序列和組織結構的相似性，去泛素化酶家族又分為6個亞家族，包括羧基末端水解酶家族UCHs、卵巢腫瘤相關蛋白OTUs、泛素特異性蛋白酶USP、MJD酶（含Machado-Joseph結構域）以及單核細胞趨化蛋白誘導的蛋白質家族（MCPIP）和JAB1/MPN/MOV34蛋白酶家族（JAMMs），其中泛素羧基末端水解酶家族UCHs屬于半胱氨酸水解酶家族是最先被人們研究并加以說明的[12]。人體UCHs家族種類眾多，包含UCH-L1、UCH-L3、UCH-L5（UCH37）、BAP1等，家族成員在氨基酸序列上有很大的相似性如UCH-L3與UCH-L1有超過55%的相似的氨基酸序列，UCH-L5與UCH-L3和UCH-L1分別有超過28%和23%氨基酸片段相同，在其中起主要作用的是UCH-L1和UCH-L3[13]。

泛素羧基末端水解酶-3作為UCHs中的起主要作用的成員，其結構和功能越來越多被人們所了解。UCH-L3有C-末端水解酶活性，能作用于泛素的羧基端將泛素上結合的小分子的肽和化合物水解為泛素單體和結合物，其通過形成Lsy48-和Lsy63-結合泛素二聚體來防止靶蛋白的降解和抑制泛素化活性[14]。研究發現UCHs家族不能水解泛素二聚體（Ub-Ub dimers），但是UCH-L3、UCH-L1、UCH-L5和BAP1可以通過直接水解Ub-SUMO2和Ub-Ube2W等泛素結合肽形式的結構蛋白N-端結合的泛素釋放出自由的泛素單體和結合蛋白[15]。UCH-L3的水解活性與每個結合蛋白底物的熱穩定性有很大的關系，底物的熱穩定性可以影響UCH-L3對底物的特異性選擇，使其有可能裂解更大更穩定的蛋白底物[16]。

2.2 UCH-L3調節的靶蛋白及參與的生物學過程

2.2.1 UCH-L3與細胞的侵襲轉移 上皮-間質轉化（EMT）在腫瘤發生發展進程及侵襲轉移中起重要作用，其表達上調可以減少上皮細胞鈣粘蛋白（E-cadherin）的表達，破壞細胞間的連接，使上皮細胞極性喪失，增加腫瘤細胞的侵襲和轉移[17]。研究表明UCH-L3可以通過調節EMT現象進而調節腫瘤的生物學行為。在不同類型的前列腺癌細胞中UCH-L3的表達水平不同其表達上調在正?；蚍寝D移性前列腺癌細胞，下調在高度轉移性前列腺癌細胞如PC3細胞和DU145細胞。敲除人正常前列腺上皮細胞1（RWPE1）的UCHl3基因，可以誘發EMT現象的形態學變化和相關因子表達的改變，如上皮細胞鈣粘蛋白（E-cadherin）表達下調及Snail、Slug、Twist、和MMPs的增加，進而促進細胞的侵襲和轉移。而增加高度轉移性前列腺癌PC3細胞中UCHL3的表達，可以逆轉EMT現象的發生，并且減少癌細胞的侵襲和轉移[18]。此外腫瘤的轉移與多種因子相關，包括過氧化氫酶、過氧化物、低氧誘導因子等能促進腫瘤的侵襲和轉移。UCH-L1可以通過水解過氧化氫酶NOX4蛋白含有賴氨酸殘基結構使其去泛素化增加NOX4的活性，提高細胞中過氧化氫酶的水平，增加細胞的侵襲和轉移[19]。敲除UCH-37基因能抑制TGF-β通路誘導的細胞侵襲和轉移，但是不能影響TGF-β通路調控的細胞周期、生長和EMT現象[20]。

2.2.2 UCH-L3與細胞凋亡 腫瘤的生長，取決于細胞的增殖與細胞死亡的比例。有研究表明泛素化是調節眾多細胞凋亡機制中重要的途徑，許多凋亡相關因子例如P53、Bcl-2家族、Caspase家族蛋白酶等是通過泛素化來調節細胞的凋亡。細長軸突萎縮癥（gad）鼠，其體內UCH-L1缺乏、泛素化的水平減少且能抵抗隱睪病對其損傷的壓力，但是檢測發現患有隱睪病的gad鼠體內的抗凋亡分子Bcl-2家族的Bcl-2、Bcl-Xl和XIAP水平以及促進生長的分子磷酸化環腺苷酸反應序列結合蛋白（pCREB）和囊源神經營養因子（BDNF）顯著增高，但是其凋亡抑制蛋白Caspase家族表達受抑制。相反的是，UCH-L3敲除的鼠患隱睪病后發現其睪丸萎縮并且促進凋亡基因P53、Bax、Caspase3的表達顯著增加。表明UCHL1在調節凋亡和抗凋亡之間的平衡起重要作用，并在精原細胞的生長和精子的發生中扮演重要角色，UCH-L3顯著的減少生殖細胞凋亡[21]。與UCH-L3序列高度相似的UCH-L1主要存在于神經元細胞中。在有肥胖癥大鼠的大腦皮層，UCHL1和UCH-L3的表達上調，上調的UCH-L1可能使P53基因穩定表達并通過P53影響Bax及Caspase3的作用誘導細胞凋亡或觸發內質網應激啟動蛋白激酶R類似內質網激酶（PERK）、轉錄激活因子6（ATF6）和X-盒結合蛋白1（XBP1）通路導致神經細胞死亡[22]。

2.2.3 UCH-L3與DNA修復 同源重組（HR）是由通過BRCA2-RAD51軸由BRCA2引入DNA雙鏈斷裂的蛋白質RAD51引導的同源鏈交換，是哺乳動物細胞DNA雙鏈斷裂修復的主要方式之一。HR的缺失會導致基因組的不穩定，也是腫瘤發生的誘因[23]。研究發現UCH-L3能使RAD51去泛素化并促進BRCA2和RAD51之間的連接。認為UCHL3是DNA修復的新型調節因子，并通過其中的一個模型磷酸化-去泛素化級聯動態調節BRCA2-RAD51途徑來實現DNA修復。過表達UCHL3的乳腺癌細胞耐輻射和化療，而UCHL3的缺失使細胞對這些治療敏感，這表明了UCHL3在癌癥治療中決定性作用[24]。為乳腺癌的靶向治療提供了新的靶點。

2.2.4 UCH-L3與其他生物進程 新的研究發現泛素羧基末端水解酶家族與精子的發生和受精過程有很大的聯系，UCH-L3表達水平對精子的數量、濃度及運動能力產生積極影響，且研究發現UCH-L3在弱精子癥和少弱精子癥的水平明顯低于精子量正常的水平，其可以作為檢驗弱精子癥和少弱精子癥患者的精子質量、受精及早期胚胎發展的指標[25]。研究人員發現提高UCH-L3的表達水平能誘導骨形成蛋白2（BMP2）啟動轉錄因子Smad1和調節下游基因的轉錄，增加Smad1的穩定性，顯著促進成骨細胞的分化，減少UCH-L3的水平能影響絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK），進而影響軟骨的形成導致面部畸形[26]。

2.3 展望 近年來，隨著對去泛素化酶家族研究的深入，泛素羧基末端水解酶-3作為去泛素化酶家族主要成員也受到人們的廣泛關注，但是目前對于UCH-L3的研究還不太充分，尚有問題亟需解決：①UCH-L3參與細胞周期的具體途徑；②UCH-L3的去泛素化作用已經明確，但是具體的切割位點還要進一步研究；③UCH-L3的表達與腫瘤細胞的轉移相關，但是相關實驗和臨床資料太少，現有研究未明確UCH-L3與腫瘤轉移方式的關系；④UCH-L3表達水平的改變可以使凋亡蛋白的表達水平發生變化，UCH-L3調節細胞凋亡的具體信號轉導通路和蛋白通路尚不明確等。因此，對UCH-L3參與調節生物活性機制的研究還應該在其具體的去泛素化位點及參與的信號通路和蛋白通路方向繼續深入，以便為疾病的靶向治療提供更多的理論支持。

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