熒光定量聚合酶鏈反應檢測支氣管肺泡灌洗液中結核分枝桿菌脫氧核糖核酸診斷肺結核的價值

吳淑紅 榮福 歐陽雁弟

【摘要】 目的 探討熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測支氣管肺泡灌洗液（BALF）結核分枝桿菌脫氧核糖核酸（TbDNA）診斷肺結核的臨床價值。方法 選取51例肺結核患者作為肺結核組， 另選60例非肺結核患者作為對照組。所有患者均完善BALF TbDNA檢測及毛刷涂片抗酸染色鏡檢、痰涂片抗酸染色鏡檢。以評價BALF中TbDNA檢測對診斷肺結核的敏感性、特異性、陽性預測值（PPV）、陰性預測值（NPV）。結果 熒光定量PCR檢測BALF中的TbDNA， 其陽性對肺結核診斷的敏感性、特異性、PPV、NPV分別為74.51%、96.67%、95.00%、81.69%， 肺結核組毛刷涂片抗酸染色鏡檢的敏感性為13.73%， 痰涂片抗酸染色鏡檢敏感性為15.69%。對照組中， 熒光定量PCR檢測BALF中的TbDNA的特異性為96.67%， 毛刷涂片抗酸染色鏡檢及痰涂片抗酸染色鏡檢的特異性均為100.00%。肺結核組熒光定量PCR檢測BALF中的TbDNA與痰涂片抗酸染色鏡檢及毛刷涂片抗酸染色鏡檢敏感性比較差異有統計學意義（P<0.05）。對照組熒光定量PCR檢測BALF中的TbDNA與毛刷涂片抗酸染色鏡檢及痰涂片抗酸染色鏡檢的特異性比較差異無統計學意義（P>0.05）。結論 熒光定量PCR檢測BALF中的TbDNA有良好的特異性和敏感性， 有望輔助傳統的檢查來早期診斷肺結核。

【關鍵詞】 熒光定量聚合酶鏈反應；支氣管肺泡灌洗液；結核分枝桿菌脫氧核糖核酸；肺結核

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.10.007

【Abstract】 Objective To disucss the clinical value of fluorescence quantitative polymerase chain reaction （PCR） in detection of mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid （TbDNA） in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Methods There were 51 pulmonary tuberculosis patients as pulmonary tuberculosis group， and 60 non-pulmonary tuberculosis patients as control group. All patients improved BALF TbDNA detection， brush smear acid-fast staining， sputum smear acid-fast staining， so as to evaluate the sensitivity， specificity， positive predictive value （PPV） and negative predictive value （NPV） of TbDNA detection in BALF for diagnosis of tuberculosis. Results TbDNA in BALF was detected by fluorescence quantitative PCR， and the sensitivity， specificity， PPV and NPV of the positive pulmonary tuberculosis were 74.51%， 96.67%， 95% and 81.69% respectively. In the pulmonary tuberculosis group， the sensitivity of brush smear acid-fast staining was 13.73%， and the sensitivity of sputum smear acid-fast staining was 15.69%. In the control group， the specificity of fluorescence quantitative PCR for detection of TbDNA in BALF was 96.67%. The specificity of brush smear acid-fast staining and sputum smear acid-fast staining were 100.00%. In the pulmonary tuberculosis group， there was statistically significant difference in sensitivity of TbDNA in BALF detected by fluorescence quantitative PCR， comparing with sputum smear acid-fast staining and brush smear acid-fast staining （P<0.05）. In the control group， there was no statistically significant difference in specificity of TbDNA in BALF detected by fluorescence quantitative PCR， comparing with brush smear acid-fast staining and sputum smear acid-fast staining （P>0.05）. Conclusion Fluorescence quantitative PCR shows good specificity and sensitivity in detection of TbDNA in BALF， and it is expected to assist traditional examination in the early diagnosis of pulmonary tuberculosis.

【Key words】Fluorescence quantitative polymerase chain reaction； Bronchalveolar lavage fluid； Tuberculosis deoxyribonucleic acid； Pulmonary tuberculosis

結核病是一個全球性的衛生問題， 據世界衛生組織統計， 其仍然是全世界的首要傳染病殺手， 2013年全球有900萬人患結核病， 其中死亡150萬人， 且近年來在世界范圍內出現流行， 呈增長的趨勢[1]。控制結核病的關鍵在于早發現， 早隔離和治療活動性肺結核[2]。結核病可累及全身多臟器， 但以肺結核最為常見。目前肺結核的病原學檢查方法主要包括培養和涂片， 但培養費時， 涂片陽性率低， 且肺結核的臨床癥狀多不典型， 且缺乏特征性的影像學表現， 因此， 部分肺結核患者無法得到早期診斷， 甚至出現漏診和誤診。熒光定量PCR檢測與常規的檢查方法比較， 敏感度高， 特異性強， 可以檢測1～100 fg純化結核分枝桿菌DNA（約相當于1～20個

結核分枝桿菌菌體的DNA量）[3]。肺泡灌洗液直接取材于遠端氣道及肺泡腔， 細菌含量高， 應用熒光定量PCR方法檢測BALF中的TbDNA， 能輔助傳統的方法早期診斷肺結核患者。本文收集2016年5月～2017年11月本科收治的51例肺結核患者及60例非肺結核患者， 所有患者均完善

BALF TbDNA檢測及支氣管鏡刷檢涂片抗酸染色鏡檢、痰涂片抗酸染色鏡檢， 以評價熒光定量PCR檢測BALF中TbDNA診斷肺結核的價值。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 收集2016年5月～2017年11月本科收治的51例肺結核患者作為肺結核組， 肺結核按照《肺結核診斷和治療指南》診斷[1]， 平均年齡（48.18±17.17）歲；其中男26例， 女25例。另選60例通過相關檢查及治療排除肺結核感染的肺部疾病患者作為對照組， 平均年齡（52.13±

18.01）歲；其中男30例， 女30例；細菌性肺炎35例， 真菌性肺炎2例， 支氣管擴張癥15例， 肺癌5例， 膿胸2例， 氣胸1例。兩組患者的一般資料比較， 差異無統計學意義（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 檢測方法

1. 2. 1 肺泡灌洗液收集， 常規氣管鏡下見異常者或者于胸片及胸部CT提示相關病灶的對應葉段支氣管行灌洗， 無菌灌洗液瓶收集BALF約20 ml， 密閉， 立即送檢， 取5 ml行熒光定量PCR法檢測TbDNA， 檢測值≥5.0E+2為陽性， <5.0E+2為陰性。

1. 2. 2 氣管鏡下行經支氣管鏡防污染刷檢， 涂片送抗酸染色。

1. 2. 3 所有患者痰標本均于漱口后留取晨痰， 進行抗酸染色后鏡檢， 其中抗酸染色鏡檢找到結核分枝桿菌為陽性， 未找到結核分枝桿菌為陰性。

1. 2. 4 試劑均采用中山大學達安基因股份有限公司生產的TbDNA試劑盒， 嚴格按照試劑盒的操作規程進行檢驗。

1. 3 統計學方法 采用SPSS23.0統計學軟件對數據進行處理。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

熒光定量PCR檢測BALF中的TbDNA， 其陽性對肺結核診斷的敏感性、特異性、PPV、NPV分別為74.51%、96.67%、

95.00%、81.69%， 肺結核組毛刷涂片抗酸染色鏡檢的敏感性為13.73%， 痰涂片抗酸染色鏡檢敏感性為15.69%。對照組中， 熒光定量PCR檢測BALF中的TbDNA的特異性為96.67%， 毛刷涂片抗酸染色鏡檢及痰涂片抗酸染色鏡檢的特異性均為100.00%。肺結核組熒光定量PCR檢測BALF中的TbDNA與痰涂片抗酸染色鏡檢及毛刷涂片抗酸染色鏡檢敏感性比較差異有統計學意義（P<0.05）。對照組熒光定量PCR檢測BALF中的TbDNA與毛刷涂片抗酸染色鏡檢及痰涂片抗酸染色鏡檢的特異性比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

3 討論

3. 1 肺結核是目前臨床上最常見的慢性傳染性疾病之

一[4]， 探索早期、快速及準確的肺結核診斷方法是目前結核病研究的重點。通常在肺結核診斷中， 痰和肺泡灌洗液、漿膜腔積液檢測結核桿菌屬于最為可靠的檢查方法， 分枝桿菌的細胞壁內含有大量脂類， 不易著色， 但若經延長染色時間及加溫后， 則不易被酸性脫色劑脫色， 根據這一原理， 臨床上疑似肺結核患者進行痰涂片找抗酸桿菌檢查， 操作簡便， 快速， 是臨床廣泛應用的肺結核診斷方法之一[5]。但本研究顯示， 痰涂片抗酸染色鏡檢方法對于肺結核診斷的敏感性僅為15.69%， 與劉潔等[6]及姜廣路等[7]研究相似。其敏感性與排菌量及痰標本收集是否恰當等有非常大的關系， 而且達到5000～10000 ml濃度才能得到陽性結果[8]， 同時本研究發現， 氣管鏡下毛刷涂片抗酸染色鏡檢的敏感性僅為13.73%， 所以， 痰及毛刷抗酸染色鏡檢無法滿足臨床早期診斷的要求。

3. 2 在全國肺結核流行病調查當中， 痰菌呈陰性的肺結核患者占總的結核病患者的60%～70%， 在實際臨床應用中， 痰菌出現陰性但通過臨床綜合資料確診肺結核的患者占70%～

80%[9]。近年來， 隨著分子生物學的迅速發展， 分子生物學技術如熒光定量PCR逐步應用于肺結核的診斷中。熒光定量PCR技術具有高敏感性、高準確性， 定量范圍廣、操作簡便、快速安全， 是污染最少的DNA體外擴增技術[10]。目前， 該技術廣泛應用于檢測痰標本、外周血及肺泡灌洗液當中， 特別是對于無空洞型、病變范圍較少的含菌量低的標本。肺泡灌洗液直接取材于遠端氣道及肺泡腔， 其接觸病灶的范圍較廣， 細菌含量高， 污染幾率較低， 同時， 灌洗時可刺激患者咳嗽， 有利于局部支氣管分泌物的引流。本研究顯示， 通過熒光定量PCR檢測肺泡灌洗液TbDNA的敏感性、特異性、PPV、NPV分別74.51%、96.67%、95.00%、81.69%， 其敏感性顯著高于痰涂片找抗酸桿菌、氣管鏡下毛刷涂片找抗酸桿菌， 與張紅漫等[11]及魏巍等[12]研究相似。熒光實時PCR技術檢測BALF中的TbDNA的結果一般1 d內獲得， 對診斷肺結核具有快速、敏感、特異的特點， 是一種值得臨床推廣的方法[13]。

3. 3 熒光定量PCR檢測BALF中的TbDNA的敏感性、特異性分別為74.51%、96.67%， 假陰性的原因包括不同人群免疫水平存在差異[6]、標本內含有大量Taq酶抑制因子抑制了PCR擴增[14]及部分病例所感染的結核分枝桿菌存在IS6110序列的缺失[15]等。本研究肺結核組共13例患者， 全部患者病程均<4 周， 其中， 9例在完善檢查前曾使用二線抗結核用藥“左氧氟沙星針”， 假陰性可能與病程較短及受到藥物影響有關。本研究在對照組中， 2例患者出現假陽性， 考慮可能與以下原因有關：①標本間的污染、標本對試劑的污染[11]；②實時定量PCR檢測TbDNA不能區分死菌還是活菌， 因此在一些非結核感染病灶及一些陳舊結核灶也有可能出現假陽性[16]；③擴增了患者體內潛伏感染的結核分枝桿菌[14]。對病情的判斷仍應該結合其他檢查結果綜合判斷。

綜上所述， 采用熒光定量PCR方法檢測BALF中的TbDNA不僅快速， 而且敏感性、特異性高， 灌洗更是有利于局部支氣管分泌物的引流， 對肺結核特別是影像學特征不典型及痰涂片檢查陰性的患者， 是一種可以提高確診率有效方法之一， 其結果可以作為肺結核的主要診斷依據指標及篩選指標。同時， 可以協助肺結核的早期診斷， 值得臨床推廣。以后， 作者將對該檢查對肺結核患者的療效進行動態觀察， 以了解其對抗結核藥物的使用指導意義。

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[收稿日期：2017-12-04]