石榴枸杞酒發酵工藝的響應面優化分析

吳昊，李秀秀

1(徐州工業職業技術學院 化學工程技術學院，江蘇 徐州，221140)2(中國礦業大學 化工工程學院，江蘇 徐州，221116)

本研究旨在將石榴與枸杞混合發酵，加入酵母菌,以充分利用果汁中的糖分生成酒精，并將石榴和枸杞中的營養成分溶出，充分汲取了兩者的活性有效成分。此酒因石榴、枸杞本身特有的清香和發酵后和諧的酒香使其風味突出，又綜合利用原料中的石榴汁和枸杞汁中固有的豐富顏色，釀制成芳香醇厚、顏色鮮亮的果酒。因此，這既能充分利用石榴枸杞的資源，增加它們的附加價值，又能促進農業經濟發展，順應了當前酒類行業的發展趨向[1-2]。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

軟籽石榴：徐州賈汪；枸杞：寧夏；酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：太古糖業有限公司；果膠酶(生化級)：江蘇銳陽生物科技有限公司；二氧化硫 (食品級)：法國進口。

1.2　儀器與設備

料理機，九陽股份有限公司；DZG-6090電熱真空干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；HH-S8電熱恒溫水浴鍋，常州市萬合儀器制造有限公司；WYT-J手持式糖度計，杭州生物科技有限公司；酒精計，河北省武強縣同輝儀表廠；BSA224S電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；GTR22-1高速冷凍離心機，北京時代北利離心機有限公司；UV-2000紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；RV10旋轉蒸發器，RV 10旋轉蒸發儀，艾卡(廣州)儀器設備有限公司。

1.3　方法

1.3.1 石榴枸杞酒的工藝流程

1.3.2石榴汁的制作

挑選個大、無損壞的石榴，去掉外皮和內種皮，用清水清洗數次，按照V(石榴)∶V(水)=1∶1的比例加水，放入料理機進行榨汁[3]。

1.3.3枸杞汁的制作

挑選個大、果肉肥厚無霉變的枸杞果，用清水清洗數次，按照V(枸杞)∶V(水)=2.5∶1的比例加水，浸泡3 h，放入料理機進行榨汁[3]。

1.3.4石榴枸杞汁成分調配

將兩種果汁按照一定比例混合200 mL放入發酵瓶中，用移液管吸取5 mL，在離心機3 600 r/min下離心10 min之后，用移液管移取上清液并測量其糖度及酸度，按每17 g/L的糖能產生1%vol酒精調整糖度，用白砂糖調整糖度，使糖度達到25%，用檸檬酸調pH在3.1～3.8之間即可[4-5]。

1.3.5混合原料預處理

將成分調配好的果汁混合液，加入一定量的SO2和果膠酶，接入活化酵母[6-9]。

1.3.6發酵工藝單因素試驗

將混合原料成分調配好后，接入酵母，發酵時間為6 d，考察石榴枸杞汁比、酵母量以及發酵溫度等3個因素對石榴枸杞酒酒精度的影響，探討單因素的最佳工藝參數。

1.3.7響應面法優化發酵工藝

根據單因素實驗，設計了石榴枸杞汁比、酵母量與發酵溫度3個因素3個水平進行響應面法優化試驗[10-13]。試驗因素水平見表1。

表1　響應面試驗因子水平編碼表Table 1　Factors and levels of response surface experiments

1.3.8果汁理化指標和酒精度的測定

按《GB/T 15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法測定果汁中的總糖、總酸、可溶性固形物等指標以及發酵酒酒精度。

1.3.9后發酵處理

前發酵結束后，將上部清液轉入另一個已滅過菌的發酵瓶中，與酵母及酒腳等沉淀物分離，在16～20 ℃下發酵30 d。

1.3.10發酵酒多酚類化合物的含量測定

因石榴中含有多種多酚類活性物質，是保健酒中重要的活性成分，因此檢測分析發酵酒中的多酚類化合物含量可作為保健酒質量的評判標準。本試驗選擇沒食子酸為標準品，應用Folin-Ciocalteu比色法進行測定[17]。

1.3.11發酵酒多糖的含量測定

由于枸杞中含有枸杞多糖的活性物質，具有抗氧化性，增強人體免疫力功效，因此檢測分析發酵酒中的多糖含量，可作為保健酒質量的評判標準。本試驗選擇以葡萄糖做標準品，用硫酸-苯酚比色法進行測定[18]。

2　結果與分析

2.1　果汁理化指標

參照國家GB/T15038—2006 標準，對石榴汁及枸杞汁的理化指標進行檢測。石榴汁：總糖11%，有機酸(以檸檬酸汁)0.62%；可溶性固形物13%；枸杞汁：總糖13%，有機酸(以檸檬酸汁)0.57%，可溶性固形物15%。石榴汁和枸杞汁中含有的總糖和可溶性固形物較為豐富，適合作為原料發酵。

2.2　石榴枸杞汁比對石榴枸杞發酵酒的影響

取經處理好的石榴枸杞汁，在酵母量4%，發酵溫度26 ℃，發酵時間6 d的條件下，考察不同石榴枸杞汁比對石榴枸杞發酵酒的影響(圖1)。

圖1　石榴枸杞汁比對石榴枸杞發酵酒的影響Fig.1　Influence of juice ration on pomegranateandmedlarfermentation wine

當石榴枸杞汁之比為2∶1(V∶V)時酒精度達到最高，可能是因為此時的石榴枸杞混合汁的滲透壓較適合釀酒酵母的生長，因此酵母代謝產生酒精含量高[19]。當逐漸增加石榴汁的比例時，由于石榴汁相比較枸杞汁來說含糖量較低，因此補加的白砂糖愈多，可能對發酵過程產生消極的影響愈明顯，當超過2∶1(V∶V)時酒精度呈下降趨向，這與添加白砂糖可能會影響到酵母的正常生長和代謝有關。因此，選擇石榴枸杞汁比1∶1、2∶1、3∶1(V∶V)做石榴枸杞酒響應面分析以確定最佳汁液比。

2.3　酵母量對石榴枸杞發酵酒的影響

取經處理好的石榴枸杞汁，在石榴枸杞汁比為2∶1(V∶V)，發酵溫度26 ℃，發酵時間6 d的條件下，考察不同酵母量對石榴枸杞發酵酒的影響(圖2)。

圖2　酵母量對石榴枸杞發酵酒的影響Fig.2　Influence of yeast inoculation quantity onpomegranateandmedlar fermentation wine

由圖2可知，隨酵母量的增加酒精度增加，糖度則相應的減少，因為酵母量越多，越有利于糖向酒精產物方向轉化，但當酵母量超過3%時，酒精度反而減小，可能是因為酵母量過多，導致微生物繁殖過快而造成底物營養缺乏，微生物產生激烈的競爭，從而影響微生物生長發酵[20]。酵母量超過3%時，由于營養源不足造成發酵酒中的含糖量略微增加，因此選擇酵母接種量為2%、3%、4%做石榴枸杞酒響應面分析以確定酵母最佳添加量。

2.4　發酵溫度對石榴枸杞發酵酒的影響

取處理好的石榴枸杞汁，在石榴枸杞汁比為2∶1(V∶V)，酵母量4%，發酵時間6 d的條件下，考察不同發酵溫度對石榴枸杞發酵酒的影響。

由圖3可知，發酵溫度不斷升高,酒精度也不斷增加，溫度到達26 ℃時酒精度達到最大值，而糖度為最小值，溫度超過26 ℃酒精度呈下降趨向，這是因為發酵溫度對酵母菌的生長繁殖有重要的影響，溫度低于26 ℃，此時沒有達到酵母菌的最適生長溫度，酵母菌生長繁殖較慢，隨著溫度的升高，酵母菌成長速度逐漸加快，26 ℃時生長繁殖最快，新陳代謝旺盛，產酒精量高。當溫度超過26 ℃時，此時影響了酵母菌的生產繁殖，代謝降低，酒精度降低，所以選擇溫度24、26、28 ℃做石榴枸杞酒響應面分析以確定最佳發酵溫度。

圖3　發酵溫度對石榴枸杞發酵酒的影響Fig.3　Influence of temperature on pomegranateand medlar fermentation wine

2.5　響應面法優化發酵工藝條件

2.5.1回歸模型的建立及方差分析

石榴枸杞酒發酵工藝的響應面優化分析結果見表2。通過Design Expert 8.0.6軟件進行實驗模型的回歸分析，并對石榴和枸杞酒發酵的最佳工藝參數進行預測。方差分析的結果見表3。

對表2中試驗數據進行多元回歸方程擬合，得到各因素水平對石榴枸杞酒酒精度(Y)影響的二次多項回歸模型方程：

Y=9.53+0.044A-0.17B+0.57C-0.058AB-0.43AC+0.045BC-1.08A2-0.44B2-0.21C2

(1)

表2　Box-Behnken試驗設計方案及結果Table 2　Results of Box-Behnken central composite design

表3　響應面結果的方差分析Table 3　Variance analysis of response surface methodology

2.5.2響應面分析及優化

結合公式(1)，采用Design Expert 8.0.6軟件繪制響應面分析圖。圖4～圖6直觀反映了各因素間的交互作用對石榴枸杞酒酒精度的影響[22]。根據統計學規律，A、B、C各因素所對應的F值越大表明該因素對響應值的影響就越大，因此可知各因素對酒精度影響的主次順序:最大的是發酵溫度，其次是石榴枸杞汁比，最后是酵母接種量。由軟件分析得最佳工藝參數：發酵溫度28 ℃、石榴枸杞汁比1.87∶1(V∶V)、酵母菌接種量2.82%，此時乙醇體積分數的預測值Y 為9.935 28%(vol)。考慮實際操作性，將發酵工藝參數修正為發酵溫度28 ℃、石榴枸杞汁比2∶1、酵母菌接種量3%。

圖4～圖6表明，石榴枸杞汁比和酵母接種量交互作用對石榴枸杞酒酒精度的影響顯著度不大，而發酵溫度和酵母接種量交互作用對石榴枸杞酒酒精度的影響非常明顯，偏高或偏低的發酵溫度以及酵母接種量都會使石榴枸杞酒酒精度降低[23]。

圖5　接種量與發酵溫度因素相互作用的等高線和響應面Fig.5　Contour and response for the alcoholicity under factorinoculation quantity and temperature interaction

圖6　石榴枸杞汁比與發酵溫度因素相互作用的等高線和響應面Fig.6　Contour and response for the alcoholicity under factorration on pomegranate-medlarjuice and temperature interaction

2.5.3驗證性試驗

在最優發酵條件下，石榴枸杞酒酒精含量的理論預測值為9.93%vol。為驗證試驗結果的可靠性，采用最佳發酵條件對石榴枸杞酒進行發酵試驗，測試結果如表6所示。由表6可以看出，3 組平行試驗的結果分別為9.92%vol、9.94%vol、9.95%vol，平均值為9.94%vol，RSD值僅為0.15%。因此，響應面法優化石榴枸杞酒發酵工藝參數準確、可靠、重現性好，具有一定的實用價值[24]。

表6　最佳發酵工藝試驗結果Table 6　Test results of the optimum fermentation process

3　結論

通過單因素試驗和中心組合設計試驗，采用響應面分析法優化石榴枸杞發酵工藝條件，建立石榴枸杞酒發酵工藝的二次多項數學模型。該模型極顯著，擬合情況較好，可用來預測設定條件范圍內石榴枸杞酒發酵工藝參數，有一定的實用價值。各因素對石榴枸杞酒發酵工藝的影響次序為發酵溫度>石榴枸杞汁比>酵母接種量，優化后工藝條件參數為發酵溫度28 ℃、石榴枸杞汁比2∶1(V∶V)、酵母菌接種量3%。在此條件下，產品酒精度可達9.94%vol，發酵所得的石榴枸杞酒香純厚，酒味突出，顏色為棕紅色，有光澤，透明度高，無苦澀味。經檢測，該酒符合食品安全國家標準《GB 2758—2012發酵酒及其配制酒》，酒體中含有豐富的活性物質，多酚類化合物含量200 mg/L，多糖含量達1.15 g/L，具有防治心血管疾病及增強人體免疫能力等保健功效[25]，是一種營養豐富的保健型發酵酒，開發前景廣闊。

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