釀酒葡萄品種SSR-PCR體系的優化與建立

馬文瑞，鄒彎，魏玉潔，嚴密，全莉，王雪薇，高林龍，馬靜，武運*，薛潔*

1(新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊，830052)2(中國食品發酵工業研究院，北京，100015)

葡萄屬于葡萄科(Vitaceae)葡萄屬(Vitis L.)，為木質藤本植物，是世界最古老的植物之一。優良葡萄品種是生產優質葡萄酒的關鍵因素之一，因此，釀酒葡萄種質資源的鑒定與分類是葡萄酒產業規范發展的基礎。葡萄主要的繁殖方式為無性繁殖，不同產區間互相引種，出現同名異物，同物異名現象頻率較高，又因葡萄種間雜交容易產生一些中間型和過渡型雜種，給葡萄的分類鑒定帶來困難[1]。隨著分子生物學技術在葡萄酒行業的發展，基于DNA指紋圖譜技術的品種鑒定方法，應用于葡萄品種鑒別方面，得到了認可與青睞。DNA指紋圖譜技術相對于傳統的細胞學，孢粉學，細胞學和生物化學鑒定方法，該技術能夠快速準確地對親緣關系很近的品種或個體進行辨別[2]。

簡單序列重復 (simple sequence repeats, SSR)技術是基于聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)的DNA指紋圖譜技術，SSR技術也稱簡單重復序列，以少數幾個堿基為單位的多次重復序列。該技術具有共顯性遺傳，可重復性高，多態性強等優點，已經廣泛應用于品種鑒定、遺傳多樣性檢測和遺傳圖譜的構建等方面，如THOMAS等人利用葡萄微衛星位點設計了5對引物，成功了區分了33個葡萄品種[3]；郭印山等人篩選出多態性高的49對SSR引物對15份不同原產地的葡萄品種進行遺傳多態性分析，結果表明，歐亞種和美洲種葡萄親緣關系相對較近，而山葡萄與二者親緣關系相對較遠，引物VMC-NG4B9和VMC3G9能將15個葡萄品種區分開[4]；張萌等人利用SSR分子標記分析了79份不同原產地的葡萄種質資源的親緣關系，結果表明說明中國野生葡萄資源和砧木品種與鮮食的栽培種親緣關系較遠[5]。成冰等人利用SSR分析技術對13個釀酒白葡萄品種進行鑒定，結果表明13個品種均有特征性引物且篩選出的引物鑒別效率差異很大， VrZAG62和VVIb66可鑒定所有品種[6]。

本試驗采用單因素與正交試驗相結合方法，對影響釀酒葡萄 SSR-PCR 擴增體系的主要因素進行優化，以期建立一套適合釀酒葡萄資源的SSR標記反應體系，為葡萄的種質鑒定及親緣關系提供參考依據。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

1.1.1試驗原料與試劑

釀酒葡萄原料：新疆天山北麓葡萄酒產區的赤霞珠，霞多麗，美樂和玫瑰香釀酒葡萄，置于-80 ℃冰箱貯藏備用。

用于SSR-PCR反應的10×PCR buffer(含 Mg2﹢15 mmol/L)、dNTPs和TaqDNA聚合酶(Taq酶)等購自于大連寶生物有限公司。D15000 DNA marker和D2000 DNA marker購買于北京天根生化科技有限公司。從相關文獻中篩選出6對釀酒葡萄SSR引物，見表1，由上海生工生物工程技術有限公司合成。經初步篩選，選用多態性好、條帶清晰的引物 VrZAG79作為單因素和正交試驗的固定引物。其他試劑均購自北京化工廠。

表1　SSR引物序列及退火溫度Table 1　Sequence and annealing temperature of SSR primer

注：F：上游引物；R：下游引物；Tm：退火溫度。

1.1.2儀器與設備

JY-CZ-BL垂直電泳槽，北京君意東方電泳設備有限公司； VeritiTM96-Well Thermal Cycler 梯度PCR儀，美國ABI公司；BG-Power600 通用電泳儀電源，北京百晶生物技術有限公司；Tanon 1600凝膠成像系統，上海天能科技有限公司；BioSpec-nano核酸蛋白檢測儀，德國Eppendorf公司；微量移液器，德國Eppendorf公司；立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠等。

1.2　試驗方法

1.2.1基因組DNA提取及質量檢測

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨法(hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)提取葡萄基因組DNA。參考齊玲倩等人的《水果果肉中總DNA提取方法的比較研究》并根據葡萄的特性加以改進[8]。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的片段大小及質量，同時在核酸蛋白儀上測定樣品DNA的濃度。赤霞珠葡萄的基因組DNA作為單因素和正交試驗的固定DNA模板。

1.2.2PCR基本反應體系

本試驗采用25 μL反應體系進行PCR擴增，參照10×PCR Buffer說明書，并根據預實驗結果建立初始體系為： 15 mmol/L Mg2﹢2.50 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 2.00 μL，5.0 U/μLTaq酶0.30 μL，10 μmol/L引物1.00 μL，50 ng/25 μL DNA模板1.00 μL，剩余用超純水補足。

1.2.3PCR反應程序及聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

95 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，退火溫度60 s，72 ℃延伸1 min，共35循環，最后72 ℃延伸7 min。PCR擴增產物用 8.0%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染檢測，在凝膠成像系統下觀察，并照相分析。使用 D2000 DNA marker(含100，250，500，750，1 000，2 000 bp 6條帶)作為DNA核酸分子量梯度的標準。

1.2.4單因素試驗設計

對影響SSR-PCR反應體系的5個因素(Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物、模板 DNA)進行單因素試驗，見表2。

表2　SSR-PCR單因素試驗設計Table 2　Single factor experiments design for SSR-PCR

單因素濃度梯度變化范圍參照陶巧靜等人的《葡萄SSR-PCR體系優化及其誘變單株遺傳多樣性分析》[9]。當1種因素為單一變量進行試驗時，其他因素按照基本反應體系的含量添加，比較不同濃度處理對 SSR-PCR 擴增結果的影響。

1.2.5正交優化試驗設計

根據單因素試驗確定的各影響因素的濃度范圍，設計L16(45)進行5因素4水平正交試驗，重復2次，優化條件見表3。PCR反應產物經8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，以確定適合釀酒葡萄SSR-PCR擴增的最佳反應體系。

表3　SSR-PCR反應因素水平L16(45)正交設計

1.2.6正交優化試驗設計結果分析

結果分析參照段永紅等人的《藥用植物苦參SSR-PCR體系的優化與驗證》[10]。數據使用SPSS 20.0進行分析。

1.2.7最優反應體系檢測

將篩選出的引物分別對赤霞珠，霞多麗，美樂和玫瑰香釀酒葡萄的DNA進行擴增，進行最優體系進行穩定性驗證。

2　結果與分析

2.1　基因組DNA提取結果檢測

由圖1可以看出，4個試驗樣品的基因組DNA提取效果良好，DNA質量較高，條帶清晰完整、無雜帶、濃度高。

M-D 15000 DNA marker；1-赤霞珠；2-霞多麗；3-美樂；4-玫瑰香圖1　釀酒葡萄基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1　Agarose gel electrophoresis of genomic DNA fromVitis vinifera

2.2　單因素試驗結果

2.2.1Mg2+濃度對SSR-PCR結果的影響

Mg2+濃度作為PCR體系最重要的變量之一。Mg2+濃度過高，可能會產生非特異性擴增；Mg2+濃度過低，會造成擴增效率降低，因此選擇合適的Mg2+濃度，提高PCR產率。圖2表明，當Mg2+濃度在0.5和1.0 mmol/L時條帶不明顯，當Mg2+濃度在1.5 mmol/L以上時出現擴增片段，當Mg2+濃度在2.0和2.5 mmol/L時，條帶清晰且多態性良好。綜合以上分析，選取Mg2+濃度在1.5～3.0 mmol/L范圍進行正交優化試驗。

2.2.2dNTPs濃度對SSR-PCR結果的影響

不同濃度的dNTPs均擴增出產物。濃度不同，擴增片段的產率和清晰度不同。圖2表明，當dNTPs為0.10和0.15 mmol/L時，條帶清晰，擴增產物的多態性最高；在0.20～0.35 mmol/L時，條帶清晰，但多態性降低；當dNTPs濃度在0.35 mmol/L時，產物多態性最低。綜合經濟角度分析，選取dNTPs濃度在0.10～0.25 mmol/L范圍進行正交優化試驗。

圖2　不同濃度Mg2+、dNTPs、Taq酶PCR產物電泳結果Fig.2　Electrophoresis of PCR amplification products withdifferent amounts of Mg2+,dNTPs, Taq DNA polymerase注：M-D2000 DNA marker；Mg2+濃度從右至左依次為0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mmol/L；dNTPs濃度從右至左依次為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mmol/L；Taq酶濃度從右至左依次為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 U

2.2.3Taq酶濃度對SSR-PCR結果的影響

Taq酶是PCR反應中最重要的因素之一。Taq酶濃度過高，產生非特異性片段的幾率增大；濃度過低，PCR擴增效率降低。不同濃度下的Taq酶均擴增出產物且條帶清晰，圖2表明，Taq酶濃度為1.25～1.75 U的多態性高于0.50～1.00 U。綜合以上分析，選取Taq酶濃度在1.00～1.75 U范圍進行正交優化試驗。

2.2.4引物濃度對SSR-PCR結果的影響

不同濃度的引物均擴增出產物。引物濃度不同，擴增片段的產率不同。圖3表明，當引物濃度為0.1～0.2 μmol/L，條帶清晰，但多態性較低。當引物濃度為0.3～0.6 μmol/L，條帶清晰，并且片段的多態性較高。綜合以上分析，選取引物濃度在0.3～0.6 μmol/L范圍進行正交優化試驗。

圖3　不同濃度引物、DNA PCR產物電泳結果Fig.3　Electrophoresis of PCR amplification products withdifferent amounts of primers and DNAM-D2000 DNA marker；引物濃度從左至右依次為0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 μmol/L；DNA濃度從左至右依次為20.00、30.00、40.00、50.00、60.00、70.00 ng/25 μL

2.2.5DNA濃度對SSR-PCR結果的影響

適當的DNA含量是增加PCR產率和特異性片段合成的首要條件。DNA含量過低，PCR產率下降；DNA含量過高，生成非特異性片段的幾率增大。圖3表明，不同濃度下的DNA均擴增出產物，但當DNA濃度在20 ng/25μL時背景顏色較淡，條帶模糊，當DNA濃度在70 ng/25μL時背景顏色較深。在30～60 ng/25μL范圍內，條帶清晰且多態性良好。綜合以上分析，選取DNA含量在30～60 ng/25μL范圍進行正交優化試驗。

2.3　正交優化試驗設計結果分析

根據正交設計表設計的16個處理組合進行SSR-PCR擴增反應，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，得出結果均有擴增產物，見圖4，2次重復結果基本一致。由于Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物、模板 DNA的濃度組合不同，擴增結果也存在著差異。1和2號組合擴增產物較少，3和4號組合條帶模糊，不易觀察；而9、10、13和14號組合擴增的條帶清晰，多態性較高，便于觀察。根據電泳圖，結合遺傳多樣性分析的要求，將擴增產物豐富度高、清晰度高、便于觀察分析的最佳產物記為16分，反之，將無擴增條帶或條帶較少、清晰度差的記為1分。根據電泳結果，分別進行2次獨立打分統計。16個處理組合得到的分數分別記為3、4、7、5、7、8、7、6、16、15、5、6、10、11、5、8；3、4、7、5、7、7、7、6、16、15、5、6、10、11、5、8。從兩次評分來看，各個組合的結果都有較高的一致性，重復性好。兩次評分取平均值，依據平均分結果進行直觀分析和方差分析。

圖4　正交設計組合PCR產物電泳結果Fig.4　Electrophoresis of PCR amplification productswith different combinationM-D2000 DNA marker；1～16表示為正交優化設計組合

根據表4，k值為每一因素水平下的數據平均值，反映了各因素不同水平對反應體系的影響情況，均值越大說明該反應水平對擴增效果越好。因此最佳25 μL體系為Mg2+濃度為2.5 mmol/L，dNTPs為0.15 mmol/L，Taq酶為1.5 U，引物為0.5 μmol/L，DNA含量為40 ng/25μL。由直觀分析中的相同因素不同水平間的均值極差R值的大小判斷各因素對PCR反應效果的影響程度，R值越大，說明該因素對結果影響越大。各因素對結果的影響程度依次為：Mg2+>Taq酶>dNTPs>引物>模板DNA。

表4　正交設計直觀分析Table 4　Intuitive analysis of orthogonal design

對16個處理組合進行方差分析，結果見表5 。由方差分析中的 F值的大小判斷各因素對反應效果的影響程度依次為：Mg2+>Taq酶>dNTPs>引物>模板DNA。結果與直觀分析一致。

表5　正交設計方差分析Table 5　Variance analysis of orthogonal design

2.4　最優反應體系檢測

根據上述試驗建立的釀酒葡萄SSR-PCR體系，使用已經篩選出的6對釀酒葡萄SSR引物，對4個釀酒葡萄品種進行聚丙烯酰胺凝膠驗證擴增效果。擴增結果如圖，均有擴增結果，條帶相對清晰，易于觀察。條帶均集中在100～500 bp左右，不同引物產生的多態性條帶為5～13條，見圖5，圖6。證明單因素和正交試驗建立的SSR-PCR體系有較高的穩定性和重復性，該體系適用于釀酒葡萄SSR反應。

圖5　4個釀酒葡萄品種SSR-PCR電泳結果Fig.5　Electrophoresis of PCR amplification products for4 Vitis vinifera varieties注：M-D2000 DNA marker；1～4表示是引物VrZAG79，樣品依次為赤霞珠，霞多麗，美樂，玫瑰香；5～8表示是引物VrZAG62，樣品依次為赤霞珠，霞多麗，美樂，玫瑰香；9～12表示是引物VVMD27，樣品依次為赤霞珠，霞多麗，美樂，玫瑰香

3　討論與結論

SSR技術是以PCR技術為核心發展起來的DNA分子標記技術，因此SSR 分子標記易受 PCR 反應體系中的主要成分以及成分間的互作影響，Mg2+、Taq酶、引物、dNTPs和模板DNA均有可能影響到擴增的敏感性、特異性以及產量，因此，SSR-PCR 反應體系的建立和優化是基于 SSR 標記研究生物遺傳多樣性的基礎。

Mg2+是Taq酶的激活劑，而且還影響引物與模板的結合效率和產物的特異性，Mg2+濃度過高可降低PCR擴增片段的特異性，同時，非特異性片段產生的幾率可能會增大；Mg2+濃度過低會影響PCR擴增產量甚至擴增不出條帶。Taq酶濃度直接影響擴增的產量和條帶的清晰度，其濃度偏高，易引起非特異性擴增，過低活性降低，降低擴增效率。本試驗結果表明，Mg2+和 Taq酶對PCR擴增影響較大，隨著濃度增加，PCR擴增效率增加，當Mg2+濃度達到2.0 mmol/L以上時，Taq酶濃度增加，擴增效果變化不明顯。這一結果與陶巧靜，劉遵春[9,11]等人的研究結果一致。dNTPs作為PCR反應的直接原材料，形成非特異性擴增，濃度過低，則會影響擴增效果；同時dNTPs還會對體系中的Mg2+產生拮抗作用，造成Mg2+濃度下降。因此本試驗結果表明dNTPs最佳的添加量為0.1 mmol/L。這一結果與李亞慧，周海蘭等人的研究結果一致[12-13]。引物的濃度同樣會影響PCR擴增反應，濃度過高會促進非特異性擴增，增加引物二聚體的形成概率，濃度過低則影響擴增效果。DNA的純度對體系擴增的穩定性有較大的影響，本試驗的模板DNA純度較高，有效提高了電泳效果，DNA濃度對SSR擴增體系影響較低，這一研究結果與潘珍珍，何仁峰等人的研究結果一致[14-15]。

本研究對影響新疆釀酒葡萄SSR-PCR反應的Mg2+、Taq酶、引物、dNTPs和模板DNA等主要成分濃度用量進行了單因素和正交優化試驗，確定新疆釀酒葡萄 SSR擴增的25 μL最佳體系：Mg2+濃度2.5 mmol/L，dNTPs為0.15 mmol/L，Taq酶為1.5 U，引物為0.5 μmol/L，DNA含量為40 ng/25μL。

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