嗜熱脂肪芽孢桿菌木聚糖酶A的H297F定點突變、表達及酶學性質(zhì)變化

李嬋娟，石慧，王曼玥，王婧

1(武漢設(shè)計工程學院 食品與生物科技學院，湖北 武漢，430205)2(湖北省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，湖北 武漢，430064)

來源于Geobacillusstearothermophilus木聚糖酶最適反應溫度在65～80 ℃之間，為高溫木聚糖酶，在烘焙、造紙等工業(yè)領(lǐng)域具有應用潛力，成為熱門研究對象[7]。ZHANG等人應用易錯PCR結(jié)合family shuffling技術(shù)將Geobacillusstearothermophilus木聚糖酶XT6的最適反應溫度從77 ℃提高到87 ℃；催化效率也提高了90%[11]。WANG等人對Geobacillusstearothermophilus木聚糖酶XynA的179位H進行飽和突變，當其突變?yōu)?79F時，催化活性和熱穩(wěn)定性均有提高[12]。本研究采用重疊延伸PCR技術(shù)對XynA保守區(qū)內(nèi)可能影響活性的位點H297定點突變?yōu)镕，以期提高XynA的熱穩(wěn)定性和催化活性。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

菌種和質(zhì)粒：木聚糖酶基因由本實驗室從Geobacillusstearothermophilus菌株中獲得并構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGEX-6p-xynA，可在大腸桿菌中異源表達；大腸桿菌EscherichiacoliDH5α、BL21(DE3)均由本實驗室保存。

培養(yǎng)基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，溶于1 000 mL蒸餾水；液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂粉即為固體培養(yǎng)基。

工具酶和生化試劑：TransStartFastPfuDNA聚合酶為北京全式金生物技術(shù)有限公司提供；限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI、T4 DNA連接酶、DNA 分子量標準和蛋白質(zhì)分子量標準購自TaKaRa 寶生物工程(大連)有限公司，AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒和AxyPrep Plasmid Miniprep Kit購自愛思進(杭州)技術(shù)有限公司，GST-蛋白純化試劑盒購自GE Healthcare公司(美國)，蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒為Beyotime公司產(chǎn)品；樺木木聚糖(birchwood xylan) 、氨芐青霉素、異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)購自Sigma 公司(美國)，其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2　儀器與設(shè)備

PCR儀，美國Biorad T100 Thermal Cycler；微量離心機，美國Thermo Heraeus Pico 17；超速冷凍離心機，美國Backman OptimeTM LE-80K；凝膠成像系統(tǒng)，中國CLiXN GenoSens1580；細胞破碎儀器，美國Thermo French Cell Press；酶標儀，美國Thermo Multiskan Spectrum。

1.3　方法

1.3.1XynAH297F定點突變

根據(jù)嗜熱脂肪芽孢桿菌木聚糖酶XynA的核苷酸序列設(shè)計引物如下：

TC(下劃線為BamHI酶切位點)；

CCAA(下劃線為XhoI酶切位點)；

CTTGACCAT(下劃線為Phe 297位點)；

GGCAATTCC(下劃線為Phe 297位點)；

利用重疊延伸PCR法對xynA的H297位點突變?yōu)镕。第一步：以構(gòu)建好的pGEX-6p-xynA質(zhì)粒為模板，以xynA-F/xynAH297F-R 和xynAH297F-F/xynA-R為引物分別擴增上游片段和下游片段。反應體系為50 μL：5×FastPfubuffer 10 μL，正向引物、反向引物(10 mmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，F(xiàn)astPfuDNA聚合酶(2.5 U/μL)1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，補充ddH2O至50 μL。反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，30個循環(huán)。第二步：取上游片段和下游片段混合為模板，以xynA-F/xynA-R為引物進行全長擴增，獲得含有酶切位點和突變位點的xynAH297F基因，反應體系同第一步。反應條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)。以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果，凝膠回收試劑盒回收DNA片段。

1.3.2重組質(zhì)粒pGEX-6p-xynAH297F的構(gòu)建

用BamH I和XhoI對回收后的PCR產(chǎn)物進行雙酶切，再回收木聚糖酶基因酶切片段，將其與相應雙酶切的pGEX-6p-1質(zhì)粒載體在4 ℃下酶連過夜，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，構(gòu)建pGEX-6p-xynAH297F重組質(zhì)粒，挑選陽性克隆進行測序驗證。

1.3.3XynA及XynAH297F在E.coliBL21(DE3)中的表達與純化

將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pGEX-6p-xynA、pGEX-6p-xynAH297F分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中。挑選含有重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)分別液體培養(yǎng)過夜，以1%的接種量分別轉(zhuǎn)接至含100 μg/mL氨芐青霉素2 L的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)A600達到0.6～0.7后，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，18 ℃，200 r/min誘導培養(yǎng)12 h。離心收集菌體，PBS懸浮后高壓破碎儀破細胞，12 000 r/min，4 ℃離心30 min，收集細胞破碎液上清，按照谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)融合蛋白純化試劑盒說明書純化重組木聚糖酶XynA及突變體XynAH297F。根據(jù)采用5%的濃縮膠和12%的分離膠進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)檢測分析，并根據(jù)蛋白定量檢測試劑盒說明書測定蛋白濃度。

1.3.4XynA及XynAH297F酶學性質(zhì)研究

采用Somogyi-Nelson 法測定木聚糖酶活性。取10 μL適量的木聚糖酶加入90 μL緩沖液配制的1%樺木木聚糖底物，一定溫度下反應10 min，再加入100 μL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)沸水浴10 min，冷卻后加ddH2O定容至1 mL，再取200 μL反應液至96孔板中，酶標儀測定A540讀數(shù)。

酶活單位定義(Unit)： 在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol木糖所需要的酶量為一個酶活力單位。

1.3.4.1XynA及XynAH297F最適pH及pH穩(wěn)定性研究

最適pH：配制不同pH值的濃度為1%底物溶液(pH 4～8緩沖液為0.2 mol/LNa2HPO4/0.1 mol/L檸檬酸緩沖液；pH 8.5～10緩沖液為50 mmol/L Gly-NaOH緩沖液)，按照上述酶活測定方法，以最高酶活為100%，計算不同pH條件下的相對酶活。

pH穩(wěn)定性：將木聚糖酶分別置于不同pH緩沖液中，室溫放置20 h后，以最適pH緩沖液配制底物測定活性，以未處理的木聚糖酶酶活為100%，計算相對酶活。

1.3.4.2XynA及XynAH297FP的最適反應溫度和熱穩(wěn)定性研究

最適反應溫度：以最適pH緩沖液配制底物，按照標準方法測定不同溫度下的酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活。

熱穩(wěn)定性：將木聚糖酶分別置于60～80 ℃處理20 min，然后在最適條件下測定酶活，以未處理的木聚糖酶酶活為100%，計算相對酶活。

1.3.5XynA及XynAH297F動力學研究

以最適pH緩沖液配制一系列不同濃度梯度的木聚糖底物，酶促反應結(jié)束后，根據(jù)Lineweaver-Burk 法，通過雙倒數(shù)作圖，求出米氏常數(shù)Km和最大速率Vmax，而催化常數(shù)Kcat=Vmax/[E]，[E]為酶濃度。

2　結(jié)果與分析

2.1　XynAH297F的定點突變

本實驗采用重疊延伸PCR進行xynA的定點突變H297F。如圖1所示，以xynA-F/xynAH297F-R和xynAH297F-F/xynA-R為引物分別擴增上游片段891 bp

M-DNA marker；1-引物xynAH297F-F/ xynA-R擴增產(chǎn)物；2-xynAH297F-F/xynA-R擴增產(chǎn)物；3-xynA-F/xynA-R擴增產(chǎn)物圖1　重疊延伸PCR擴增xynAH297F基因Fig.1　XynAH297F gene amplified by overlapping extension PCR

和下游片段105 bp，第二輪PCR以xynA-F/xynA-R為引物進行全長擴增所得片段大小為996 bp，與預期一致。構(gòu)建重組質(zhì)粒并測序驗證，將成功的突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中進行表達與純化。

2.2　XynA及XynAH297F的誘導表達和純化

將帶有重組質(zhì)粒pGEX-6p-xynA、 pGEX-6p-xynAH297F的E.coliBL21(DE3)分別誘導表達，破細胞后利用SDS-PAGE檢測蛋白表達情況。如圖2-A所示，帶有空載質(zhì)粒菌株誘導后只表達了26 ku的GST標簽，且主要存在上清中；含有重組的pGEX-6p-xynA和pGEX-6p-xynAH297F菌株均表達了64 ku的融合蛋白，雖然主要存在沉淀中，但是上清中也存在可溶的融合蛋白。經(jīng)過親和層析、3C蛋白酶切除GST標簽后，最終獲得高純度的木聚糖酶。經(jīng)SDS-PAGE分析，純化后的蛋白條帶單一，且大小約為38 ku，與預期一致，說明所得蛋白即為目標蛋白。

A-XynA和XynAH297P在BL21(DE3)中的表達分析。M-蛋白質(zhì)marker；1-IPTG誘導的含pGEX-6p-1的E. coliBL21(DE3)表達上清；2-IPTG誘導的含pGEX-6p-1的E. coli BL21(DE3)表達沉淀；3-IPTG誘導的含pGEX-6p-xynA的E. coliBL21(DE3)表達上清；4-IPTG誘導的含pGEX-6p-xynA的E. coliBL21(DE3)表達沉淀；5-IPTG誘導的含pGEX-6p-xynAH297F的E. coli BL21(DE3)表達上清H297P上清；6-IPTG誘導的含pGEX-6p-xynAH297F的E. coli BL21(DE3)表達上清H297P沉淀。B-M-蛋白質(zhì)marker；1-純化后的XynA；2-純化后的XynAH297P圖2　XynA和XynAH297P的表達與純化SDS-PAGE分析Fig.2　SDS-PAGE analysis of XynA and XynAH297P

2.3　XynA和XynAH297F酶學性質(zhì)

2.3.1最適反應pH和pH的穩(wěn)定性研究

如圖3-A所示，野生型XynA與突變體XynAH297F的最適反應pH值均為5.5，且在不同pH緩沖液中相對活性幾乎相同。由圖3-B可知，野生型XynA在pH 4～10的緩沖液中室溫處理20h后殘余活性均在90%左右；相同處理條件下，XynAH297F殘余活性均在95%左右。XynA與突變體XynAH297F均具有較好的pH穩(wěn)定性，且兩者的pH穩(wěn)定性也幾乎相同。說明H297位點對該酶的最適pH和pH穩(wěn)定性不起關(guān)鍵作用。

A-XynA和XynAH297P的最適反應pH測定; B-XynA和XynAH297P的pH穩(wěn)定性研究圖3　XynA和XynAH297P的最適反應pH及pH穩(wěn)定性研究Fig.3　The optimum pH and pH stability of the purified XynAand XynAH297P

2.3.2XynA及XynAH297P最適反應溫度及熱穩(wěn)定性研究

測定不同溫度下XynA和XynAH297F的相對活性，如圖4-A所示，XynA的最適反應溫度為70 ℃；XynAH297F的最適反應溫度為75 ℃，與野生型相比提高了5 ℃。分別測定XynA和XynAH297的熱穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，65 ℃處理20 min后，XynA殘余活性降低至80%左右，而XynAH297活性幾乎不變；80℃處理20 min后，XynA的殘余活性降低至10%左右，而XynAH297仍具有30%左右的殘余活性，說明突變體的熱穩(wěn)定性優(yōu)于野生型。

A-XynA和XynAH297P的最適反應溫度；B-XynA和XynAH297P的熱穩(wěn)定性圖4　XynA和XynAH297P的最適反應溫度及熱穩(wěn)定性研究Fig.4　The optimum temperature and thermal stability of XynAand XynAH297P

2.4　XynA及XynAH297P的動力學參數(shù)的測定

以不同濃度的木聚糖為底物，測定XynA和XynAH297P的活性，采用雙倒數(shù)作圖法計算動力學參數(shù)。從表1可以看出，與重組野生型酶相比，突變體XynAH297P的Km增大，說明H297位點突變成F后導致酶對底物的親和力下降。但突變體Vmax和Kcat均增大了1倍，說明突變后酶促催化速率增大，酶活也提高了1倍。

表1　XynA及XynAH297P的動力學參數(shù)Table 1　Kinetic parameters for XynA and XynAH297P

2.5　同源建模

Swiss-model 服務器以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中已經(jīng)報道的GeobacillusstearothermophilusT6(IXT6; PDB code 3mui)木聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)為模板，模擬出突變型酶的三維結(jié)構(gòu)模型。從圖5可以看出，Glu44和Asn45是酶與底物結(jié)合的關(guān)鍵殘基，可能與底物木四糖形成氫鍵。H297突變?yōu)镻he后，底物的空間位置有一定改變，可能影響Glu44和Asn45與底物的作用力，使得酶對底物的親和力下降。另外，如圖5所示，Phe取代His后側(cè)鏈角度向外偏轉(zhuǎn)，活性空腔變大，可能有利于產(chǎn)物的釋放，從而增大酶促反應速率。同時，Phe的苯環(huán)結(jié)構(gòu)的疏水性大于His的咪唑基團，有研究表明，引入疏水性氨基酸有利于提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性[13]。李同彪等人對黑曲霉木聚糖酶XynZF-2進行突變引入芳香族氨基酸和其他疏水性氨基酸后都明顯改善了XynZF-2的熱穩(wěn)定性、最適反應溫度等[14-15]。

藍色代表突變前酶蛋白結(jié)合的底物分子木四糖；黃色代表突變后酶蛋白結(jié)合的底物分子；綠色代表his297殘基；紅色代表突變后的Phe殘基圖5　利用Siwss-Model 模擬XynA及XynAH297P的結(jié)構(gòu)圖Fig.5　The molecular simulation of XynA and XynAH297Pby Siwss-Model

3　結(jié)論

本研究利用重疊延伸PCR對嗜熱脂肪芽孢桿菌木聚糖酶XynA活性中心附近的H297位點突變?yōu)镕。在大腸桿菌中異源表達并純化相關(guān)蛋白，比較研究野生型木聚糖酶XynA和突變體XynAH297P的酶學性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，H297突變?yōu)镕后，酶的最適pH和pH穩(wěn)定性不受影響，但最適反應溫度和熱穩(wěn)定性有所提高。F297取代H297后，酶對底物的親和力下降，但催化反應速率有一定程度提高。本結(jié)果為木聚糖酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究提供了材料。

[1]DEUTSCHMANN R,DEKKER R F H.From plant biomass to bio-based chemical: latest developments in xylan research [J].Biotechnology Advances,2012, 30(6):1 627-1 640.

[2]MCCLEARY B V,MCKIE V A,DRAGA A,et al.Hydrolysis of wheat flour arabinoxylan, acid-debranched wheat flour arabinoxylan and arabino-xylo-oligosaccharides by β-xylanase,α-L-arabinofuranosidase and β-xylosidase[J].Carbohydrate Research,2015, 407(30):79-96.

[3] MOREIRA L R,FILHO E X.Insights into the mechanism of enzymatic hydrolysis of xylan[J].Applied Microbiology And Biotechnology.2016,100(12):5 205-5 214.

[4]CARVALHO E A,DOS SANTOSGóES L M,UETANABARO A P,et al.Thermoresistant xylanases fromTrichodermastromaticum: Application in bread making and manufacturing xylo-oligosaccharides[J].Food Chemistry,2017,221(15):1 499-1 506.

[5]DHIMAN S S,GARG G,SHARMA J,et al.Characterization of statistically produced xylanase for enrichment of fruit juice clarification process[J]. New Biotechnology,2011,28(6):746-755.

[6]WANG X,LUO H,YU W,et al.A thermostable Gloeophyllum trabeum xylanase with potential for the brewing industry[J].Food Chemistry,2016,199(15):516-523.

[7] KUMAR V,MARíN-NAVARRO J,SHUKLA P.Thermostable microbial xylanases for pulp and paper industries: trends, applications and further perspectives[J].World Journal of Microbiology & Biotechnology,2016,32(2):34-43.

[8]吳芹,胡蝶,李雪晴,等.Y13F定點突變改良米曲霉中溫木聚糖酶的耐熱性[J].中國生物工程雜志,2016,36(12):36-41.

[9]RULLER R,ALPONTI J,DELIBERTO L A,et al.Concommitant adaptation of a GH11 xylanase by directed evolution to create an alkali-tolerant/thermophilic enzyme[J].Protein Engineering Design & Selection,2014,27(8):255-262.

[10]DESOUZA A R,DE ARAúJO G C,ZANPHORLIN L M,et al.Engineering increased thermostability in the GH-10 endo-1,4-β-xylanase fromThermoascusaurantiacusCBMAI 756[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,93(Pt A):20-26.

[11]ZHANG Z G,YI Z L,PEI X Q, et al.Improving the thermostability ofGeobacillusstearothermophilusxylanase XT6 by directed evolution and site-directed mutagenesis[J]. Bioresource Technology,2010,101(23):9 272-9 278.

[12]WANG Y,FENG S,ZHAN T, et al.Improving catalytic efficiency of endo-β-1, 4-xylanase fromGeobacillusstearothermophilusby directed evolution and H179 saturation mutagenesis[J].Journal of Biotechnology,2013,168 (4):341-347.

[13]楊浩萌,姚斌,范云六.木聚糖酶分子結(jié)構(gòu)與重要酶學性質(zhì)關(guān)系的研究進展[J].生物工程學報,2005,21(1):6-11.

[14]李同彪,周晨妍,朱新術(shù)，等.引入疏水性氨基酸對GH11家族木聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響[J].食品工業(yè)科技,2016,37(1):145-152.

[15]李同彪,周晨妍,朱新術(shù)，等.N-端二硫鍵及芳香族氨基酸對木聚糖酶XynZF-2熱穩(wěn)定性的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2016,42(1):26-30.