一株毛色二孢菌發酵產茉莉酸

董文華，鄭璞，陳鵬程，趙路平

(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室， 江蘇 無錫，214122)

茉莉酸(化學名稱3-氧-2-2′-順-戊烯基-環戊烷-1-乙酸，分子式C12H18O3)是一種新型的植物激素。它普遍存在于植物的花、莖、葉、根等組織、器官中，在植物的生長發育過程中發揮著重要的作用[1]；它可作為第二信號，當植物受到生物與非生物的傷害時誘導激活植物體內的防御基因，抵御外界的傷害[2]。在農業生產中，可以代替部分殺蟲劑，并可用于提高植物的抗旱性[3]。在香料業的生產中，茉莉酸及其甲酯因具有清淡、幽雅的香味可作為很多香花精油主香的成分，應用于香煙、肥皂、口香糖等的生產中[4]。

DEMOLE最先從素馨花中發現并提取到茉莉酸類似物[6]，但在植物中茉莉酸的含量低(10-9～10-6g/g)，滿足不了當今市場的需求。化學合成法存在反應收率不高(30%以下)，反應條件苛刻，合成的產物具有外消旋的缺陷，限制了其使用的范圍[7-9]。因此，微生物發酵生產茉莉酸受到人們的關注。ALDRIDGE等[10]最早在可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobroma)的培養液中，分離到茉莉酸。此外，MIERSCH等[11-12]發現突變的藤倉赤霉菌(Gibberellafujikuroi)在添加了對氯苯氧乙酸鈉后的發酵培養液中，也能檢測到茉莉酸類化合物。這些發現使得用微生物發酵茉莉酸成為可能。美國國際香精香料公司的FARBOOD和BLOCKER等[13]研究了棉色二孢菌(Diplodiagossypina)發酵產茉莉酸及茉莉酸甲酯的方法，并且比較了不同發酵培養基、發酵條件對該類菌產茉莉酸的影響，其中D.gossypinaATCC 10936產茉莉酸質量濃度可達1.2 g/L。印度薩達爾帕特爾大學通過優化L.theobromae發酵培養基的成分，在最佳的培養條件下,L.theobromaeMTCC 3068最高產茉莉酸為225.3 mg/L[5]。國內韓曉敏等[14]研究可可毛色二孢菌對白木香產生倍半萜的誘導作用時，在可可毛色二孢菌的培養液中檢測到茉莉酸類化合物，將它們甲酯化后，質量濃度為250.55 mg/L。目前國內尚未見茉莉酸發酵方面的研究報道。

本文從實驗室保藏和自然界分離收集的121株霉菌中，篩選到1株高產茉莉酸的霉菌，對其進行了菌種鑒定和發酵條件的研究，為微生物發酵法生產茉莉酸提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1菌種

LasiodiplodiairanensisDWH-2保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號CCTCC NO：M2017288，從腐爛的玉蕊根中篩選得到。

1.1.2主要試劑

茉莉酸標準品購買于一飛生物科技有限公司；甲醇、乙腈，色譜純；磷酸、鹽酸，分析純。以上試劑及實驗所用培養基成分均來自于國藥集團化學試劑有限公司。大豆油購于中糧集團。薄層層析硅膠板GF254購于青島海洋化工廠分廠。

1.1.3培養基

斜面培養基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，瓊脂20，自然pH。

初始發酵培養基(g/L)：蔗糖50,NaNO37.5，KH2PO42.0，KCl 0.3，MgSO4·7H2O 6，FeSO4· 7H2O 0.6，酵母膏1，麥芽提取物2，微量元素10ml/L pH 5.5。

微量元素：ZnSO4· 7H2O 0.03 g/L，MnSO4·7H2O 0.003 g/L，CuSO4· 7H2O 0.003 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.003 g/L。

優化后發酵培養基(g/L)：蔗糖50，NaNO34.5，KH2PO42.0，KCl 0.4，MgSO4·7H2O 6，FeSO4·7H2O 0.9，玉米漿1.5，大豆油10，微量元素10 ml/L pH 5.5。

1.1.4主要儀器與設備

SW-CJ-IFD超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；Quanta-200掃描電子顯微鏡，荷蘭FEI公司；高效液相色譜儀，美國Waters公司；ZD-2雷磁自動滴定儀，上海儀電科技有限公司；SHIMADZU GCMS-QP2010 氣相色譜-質譜聯用儀，島津企業管理(中國)有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1產茉莉酸菌株的篩選

在PDA平板上活化實驗室保存的霉菌，并將其接入發酵培養基中，28 ℃培養6 d后，取處理好的發酵上清液，用薄層層析(thin layer chromatography, TLC)方法進行初步的定性分析。收集果蔬、植物等的腐爛部位，每份篩菌材料經過相同的處理之后稀釋涂布于PDA抗性平板上(100 mg/L的氯霉素)，28 ℃培養4 d，觀察菌落形態，挑出單菌落，培養后將其接于發酵培養基中，28 ℃培養6 d后，取發酵上清液,處理后通過TLC方法進行初步的定性分析。

1.2.2種子培養

斜面種子接于PDA平板上，在28 ℃下培養。

1.2.3發酵培養基碳源的確定

按1.2.2的種子培養方法，分別以等碳摩爾數的蔗糖、乳糖、淀粉、麥芽糖、葡萄糖、果糖為唯一碳源，根據菌株生長及產物質量濃度確定最合適的碳源后，設置25、50、75、100、125、150 g/L的碳源質量濃度梯度，確定碳源的最適質量濃度。

1.2.4發酵培養基無機氮源的確定

按1.2.2的種子培養方法及1.2.3確定的碳源，分別以等氮摩爾數的NaNO3、脲素、NH4NO3、NH4Cl、(NH4)2SO4為唯一無機氮源，根據菌株生長及產物質量濃度確定最合適的無機氮源后，設置3、4.5、6、7.5、9、10.5 g/L的無機氮源質量濃度梯度，確定無機氮源的最適質量濃度。

1.2.5發酵培養基有機氮源的確定

按1.2.2的種子培養方法及1.2.3確定的碳源、1.2.4確定的無機氮源，將牛肉膏、蛋白胨、玉米漿、酵母膏、麥芽提取物分別以2 g/L的添加量作為唯一的有機氮源加入發酵培養基中，且以初始培養基中同時添加酵母膏、麥芽提取物為對照組, 根據菌株生長及產物質量濃度確定最合適的有機氮源后，設置1、1.5、2、2.5、3 g/L的有機氮質量濃度梯度，確定有機氮源的最適質量濃度。

1.2.6發酵培養基無機鹽及微量元素的確定

按1.2.2的種子培養方法及1.2.3確定的碳源、1.2.4確定的無機氮源、1.2.5確定的有機氮源，通過正交實驗考察KH2PO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O以及微量元素濃度對菌體生長以及產物質量濃度的影響。

1.2.7發酵培養基初始pH的確定

在以上培養基成分優化的基礎上，按1.2.2的種子培養方法，設置發酵的初始pH為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，發酵7 d。

1.2.8裝液量的確定

在以上培養基成分優化的基礎上，按1.2.2的種子培養方法、1.2.7確定的最適初始pH，設置500 mL搖瓶的裝液量為50、100、150、200、250 mL，發酵7 d。

1.2.9發酵溫度的確定

在以上培養基成分優化的基礎上，按1.2.2的種子培養方法、1.2.7確定的最適初始pH、1.2.8確定的最適裝液量，設置培養溫度分別為20、25、28、30、35、40 ℃，發酵7 d。

1.2.10大豆油添加量的確定

在以上培養基成分及培養條件優化的基礎上，按1.2.2的種子培養方法設置大豆油的濃度為1、5、10、15、20 g/L五個質量濃度梯度，發酵7 d，根據菌株生長及產物質量濃度確定最合適的大豆油添加量。

1.2.11發酵罐上的初步擴大培養

在以上培養基成分及培養條件優化的基礎上，在3 L的發酵罐中裝液量1.5 L，發酵12 d，測定茉莉酸的含量。

1.3　分析方法

1.3.1TLC檢測方法

取適量的發酵液與茉莉酸標樣一起點于硅膠板上，將點好的薄層板放在展缸中，待展開劑前沿跑到板長的2/3處時將其取出，晾干，噴灑顯色劑，加熱一段時間，觀察是否有與標樣一樣的紅色斑點出現。

展開劑V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(醋酸)=60∶40∶1

顯色劑V(濃硫酸)∶V(甲醇)=1∶1

1.3.2HPLC檢測方法

取適量發酵液12 000 r/min離心15 min，取上清液與等體積的甲醇混合后過膜，通過HPLC檢測。

色譜條件，色譜柱：Amethyst C18-H(4.6 mm×250 mm，5 μm)反相色譜柱，檢測波長210 nm，柱溫35 ℃，流動相為V(甲醇)∶V(0.1%磷酸)=11∶9，進樣量為20 μL，流速1 mL/min。

1.3.3GC-MS檢測

氣質條件：色譜柱(DB-5 ms，30.0 m×0.25 mm×0.25 μm),初始溫度60 ℃，保持時間0.6 min，終溫度為280 ℃。柱箱溫度60 ℃，進樣口溫度270 ℃，進樣方式不分流，離子源溫度200 ℃，接口溫度280 ℃。

1.3.4生物量的測定

發酵結束后，取出菌體放于已稱重的烘干濾紙上，于70 ℃真空干燥箱中烘至恒重，以恒重減去濾紙重即得菌體的質量。

1.4　菌種鑒定

1.4.1菌株DWH-2電鏡方法

挑取適量的生長旺盛的菌體，用5%戊二醛進行前固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗；1%鋨酸進行后固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗；后用乙醇梯度脫水，在臨界點干燥后將樣品粘貼于樣品臺，離子濺射儀鍍膜后置于掃描電子顯微鏡下觀察。

1.4.2菌株DWH-2 ITS鑒定方法

菌株基因組DNA用Ezup柱式真菌基因組抽提試劑盒進行提取，ITS區域的擴增選擇真核生物ITS的通用擴增引物：

ITS1 5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

ITS4 5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

PCR反應體系：

Template(基因組 DNA20-50 ng/μL)0.5 μL

10×Buffer(with Mg2+)2.5 μL

dNTP(各2.5 mmol/L)1.0 μL

Taq聚合酶0.2 μL

上游引物0.5 μL

下游引物0.5 μL

加雙蒸水至25 μL

PCR循環條件為94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環，最后72 ℃延伸10 min。

PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進行測序。

2　結果與討論

2.1　產茉莉酸菌株的篩選及其產物鑒定

按1.2.1的篩選方法，將得到的121株菌發酵后用TLC方法分析發酵上清液，得到3株疑似產茉莉酸的菌株，TLC圖譜如圖1所示。對這3株菌進行復篩，用GC-MS對發酵液中的產物鑒定，證實它們的發酵液中存在茉莉酸，如圖2所示，經HPLC測定，DWH-2合成茉莉酸的量最多，質量濃度達到320 mg/L。

圖1　部分菌株發酵液TLC圖譜Fig.1　TLC patterns of some strains

a-發酵液產物GC分析；b-茉莉酸MS分析圖2　菌株DWH-2發酵液GC-MS定性分析Fig.2　GC-MS analysis of fermentation broth of DWH-2

2.2　高產菌DWH-2的鑒定

DWH-2形態特征：DWH-2在PDA平板上生長時，菌落的正面為白色，絨毛狀，菌絲疏松，呈蔓延生長狀態(培養初期背面為白色，4 d后變為綠色，最后為黑色)。在透射電鏡下觀察到該菌的分生孢子呈卵圓形或橢圓形，平均長度均小于25 μm，表面光滑，具有縱條紋。

ITS鑒定：真核生物rDNA的ITS區段既具有保守性又在科、屬、種水平上具有差異性，常用其來鑒定真核微生物。將生長旺盛的DWH-2送至上海生工進行ITS測序，得到了大小為519 bp的序列。在NCBI中檢索與該菌株序列相似性較高的菌株，結果表明DWH-2與GenBank數據庫中二孢屬的多株菌同源性高達98%～100%。下載了同源性較高的菌株序列進行比對，發現DWH-2與菌株LasiodiplodiairanensisisolateCMW25232親緣關系最近，并將其命名為LasiodiplodiairanensisDWH-2。以菌株DWH-2的ITS序列為基礎構建的進化樹如圖4所示。

a，b-DWH-2在平板上生長的正面與背面;c，d-DWH-2電鏡圖圖3　菌株DWH-2形態學鑒定Fig.3　Morphological identification of strain DWH-2

圖4　基于菌株DWH-2的ITS序列構建的系統進化樹Fig.4　Phylogenetic tree of strain DWH-2 based onITS sequences

2.3　發酵培養基碳源的確定

在以蔗糖、麥芽糖、葡萄糖為唯一碳源時，菌體的生物量均可達17 g/L左右，但是以蔗糖為碳源時產物質量濃度要明顯高于其他碳源，達到了342 mg/L，如圖5所示，所以選擇蔗糖為最適碳源；確定蔗糖的最適質量濃度實驗結果如圖6所示，在發酵過程中，隨著蔗糖含量的增加，菌體的生物量也在增加，但產物的質量濃度卻在蔗糖質量濃度為50 g/L時達到最高值，為437 mg/L，所以產物的產生不需要很高的糖含量，故采用50 g/L為蔗糖的最佳質量濃度。

圖5　不同碳源對菌株生長及產物質量濃度的影響Fig.5　Effects of different carbon sources on cellgrowth and product concentration

圖6　蔗糖濃度對菌株生長及產物濃度的影響Fig.6　Effects of sucrose concentration on cellgrowth and product concentration

2.4　發酵培養基無機氮源的確定

在以硝酸鈉為唯一無機氮源時，不論是產物質量濃度還是菌體的生物量都明顯高于其他的無機氮源，故選擇硝酸鈉為最適的無機氮源(圖7)；為了考察硝酸鈉的最適質量濃度，設置了6個質量濃度梯度，結果如圖8所示，隨著硝酸鈉質量濃度的增加菌體的生物量也呈現不斷增加的趨勢，說明硝酸鈉對菌體的生長有顯著的影響，但是產物的質量濃度卻呈現與之相反的趨勢，先增加后減少。在硝酸鈉質量濃度為4.5 g/L時，產物質量濃度最高，達到688 mg/L，故選用4.5 g/L作為硝酸鈉的最適質量濃度。

圖7　不同無機氮源對菌株生長及產物濃度的影響Fig.7　Effects of different inorganic nitrogen sourceson cell growth and product concentration

圖8　硝酸鈉質量濃度對菌株生長及產物的影響Fig.8　Effects of sodium nitrate concentration oncell growth and product concentration

2.5　發酵培養基有機氮源的確定

以對照組為參照，以玉米漿為唯一的有機氮源時，產物質量濃度是最高的，為700 mg/L，如圖9所示，此時的生物量為13.9 g/L略低于對照組的15.3 g/L，綜合考慮選擇玉米漿做為唯一的有機氮源；為了確定最適的玉米漿添加量，設置了5個梯度，結果如圖10。從圖10可以看出，玉米漿質量濃度對菌體的生物量有一定的影響，但對產物質量濃度沒有明顯的影響，在1～3 g/L的范圍內產物質量濃度基本保持在680～715 mg/L之間，但在1.5 g/L時，產物質量濃度最高為715 mg/L，故選擇1.5 g/L為最適的有玉米漿質量濃度。

圖9　有機氮源對菌體及產物質量濃度的影響Fig.9　Effects of organic nitrogen on cellgrowth and product concentration

圖10　玉米漿質量濃度對菌體及產物濃度的影響Fig.10　Effects of corn syrup concentration oncell growth and product concentration

2.6　發酵培養基無機鹽及微量元素的確定

本實驗通過設計正交實驗考察了KH2PO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O以及微量元素對茉莉酸合成及菌體的影響，設計了5因素4水平的正交實驗L16(45)，實驗設計如表1，實驗結果如表2。

微量元素配方：FeSO4·7H2O 0.6 g/L；ZnSO4·7H2O 0.03 g/L；MnSO4·7H2O 0.003 g/L；CuSO4·7H2O 0.003 g/L；二水合鉬酸鈉0.003 g/L。

從實驗結果來看，MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O是最顯著的2個影響因素，以茉莉酸的產量為標準，得到的無機鹽的最優組合為：KH2PO42 g/L、KCl 0.4 g/L、MgSO4·7H2O 6 g/L、FeSO4·7H2O 0.9 g/L、微量元素10 mL/L。

表1　不同元素水平Table 1　Levels of different elements

表2　無機鹽及微量元素正交表Table 2　Inorganic salts and trace elements orthogonal table

2.7　發酵初始pH對菌株產茉莉酸的影響

發酵液的pH在發酵過程中隨菌體生長情況的變化而變化，從而影響代謝產物的分泌。從圖11可以看出在發酵過程中，隨著pH的升高，菌體的生物量及產物濃度都呈現一個先增加后降低的趨勢，在pH為4.5的時候，有產物的產生，但菌體的生物量偏低，在pH為5.5時，產物濃度及菌體量都達到了最高值，故確定發酵初始pH為5.5。

圖11　初始pH對菌體及產物質量濃度的影響Fig.11　Effect of initial pH on cell growth and productconcentration

2.8　裝液量對菌株產茉莉酸的影響

絕大多數微生物在生長過程中是需要氧的，發酵過程中裝液量的多少直接影響發酵液中所溶解氧的濃度，進而影響菌體的生長及代謝產物的分泌。由圖12可知，當裝液量為50 mL/500 mL時，菌體的生物量達到最大值為17.5 g/L，隨著裝液量的增加菌體生物量在減少而產物濃度卻先增加后減少，說明該菌的生長是需要氧的，但產物的產生卻不需要太多的氧。裝液量為100 mL/500 mL時產物濃度達到最大，故選擇100 mL/500 mL為最佳裝液量。

2.9　發酵溫度的確定

溫度對菌體生長及代謝產物的分泌有重要的影響，溫度的高低會影響菌體所產酶的活性從而影響次級代謝產物的產生。如圖13所示，該菌株的最適生長溫度為25～30 ℃，高于30 ℃菌體幾乎不生長。且產物產生的最適溫度與菌體生長的最適溫度基本保持一致，在28 ℃時，產物濃度達762 mg/L，故選28 ℃為最適的發酵溫度。

圖12　裝液量對菌體及產物濃度的影響Fig.12　Effect of liquid volume on cell growth and productconcentration

圖13　發酵溫度對菌體生長及產物濃度的影響Fig.13　Effect of temperature on cell growth andproduct concentration

2.10　大豆油添加量的確定

茉莉酸合成途徑中的第一個關鍵酶為脂氧合酶，大豆油可以提高脂氧合酶的活性，所以在發酵過程中加入適量的大豆油以期提高茉莉酸的產量，實驗結果如圖14所示。添加大豆油后產物的濃度有所提高，基本上在1 100～1 540 mg/L的范圍內，在大豆油添加量為10 g/L時，產物濃度達到最高為1 543 mg/L。由此可以看出，大豆油可以提高產物濃度，可能的原因就是大豆油的加入提高了該合成途徑中第一個關鍵酶脂氧合酶的活性，且大豆油也可作為發酵碳源，使最終的產物濃度增加。

圖14　大豆油添加量對菌體及產物質量濃度的影響Fig.14　Effects of Soybean Oil concentration on cellgrowth and product concentration

2.11　發酵罐上的初步擴大培養

在以上優化的基礎上把該菌株在3 L的發酵罐上做了一次初步的擴大培養，實驗結果如圖15所示。在發酵過程中pH先降低后升高，茉莉酸的產生與菌株的生長也不是同步的，而是在發酵的第四天開始出現，此時pH也在開始回升，在發酵后期當pH接近于8時，茉莉酸積累量減少且出現分解的現象，發酵過程茉莉酸最高積累量達1 292 mg/L。發酵到12 d時，茉莉酸的積累量開始下降，并且與搖瓶發酵相比，發酵罐上的發酵周期較長，說明發酵罐的發酵條件有待進一步研究。

圖15　發酵罐中菌體生長與產物積累情況Fig.15　Cell growth and accumulation of product in fermenter

3　結論

本文從121株霉菌中篩選到1株高產茉莉酸的菌株LasiodiplodiairanensisDWH-2，并對該菌株產茉莉酸的發酵培養基的碳源、氮源、無機鹽及發酵條件如pH、溫度、裝液量等做了初步優化，使茉莉酸的產量由原來的320 mg/L提高到1 543 mg/L。并且在3 L發酵罐上擴大培養時，DWH-2可以產1 292 mg/L的茉莉酸。

[1]LIAN Qing-long, XIN Hai-bo,LI Xiao-xin,et al. Isolation, characterization and expression analysis of the genes—GhAOS, GhAOC and GhOPR3: Encoding the key enzymes involved in jasmonic acid biosynthesis in Gladiolus hybridus[J].ScientiaHorticulturae, 2013, 154(2):88-95.

[2]Nabity P D, Zavala J A, Delucia E H. Herbivore induction of jasmonic acid and chemical defences reduce photosynthesis in Nicotianaattenuata[J].Journal of Experimental Botany, 2013, 64(2):685-694.

[3]李倩楠, 唐清華, 周琪. 茉莉酸對植物生長發育的作用以及在農業生產上的應用[J].安徽農學通報, 2008, 14(12):38-38.

[4]朱宏濤, 李江, 李元,等. 激素類農藥茉莉酸及其甲酯的植物生物活性及其在農業生產中的應用[J].農藥, 2013(8):552-557.

[5]DHANDHUKIA P C, THAKKAR V R. Significant medium components for enhanced Jasmonic acid production byLasiodiplodiatheobromaeusing Plackett-Burman design[J].Current Trends in Biotechnology & Pharmacy, 2007, 1(1):79-86.

[6]李清清, 李大鵬, 李德全. 茉莉酸和茉莉酸甲酯生物合成及其調控機制[J].生物技術通報, 2010(1):53-57.

[7]洪忠, 陳虎保. 天然生理活性物質茉莉酸及其甲酯的生理作用與生物化學合成[J].農藥, 2000, 39(5):8-11.

[8]TSUKADA K, TAKAHASHI K, NABETA K. Biosynthesis of jasmonic acid in a plant pathogenic fungus,Lasiodiplodiatheobromae[J]. Phytochemistry, 2010, 71(17): 2 019-2 023.

[9]李祖光,李建亮,沈德隆. 茉莉酸類化合物的合成研究進展[J].浙江化工,2008,09:19-23+5.

[10]ALDRIDGE D C, GILES D, TURNER W B. Antibiotic 1233A: a fungal, -lactone.[J].Journal of the Chemical Society Perkin Transactions, 1971, 23(8):3 888.

[11]MIERSCH O, BRüCKNER B, SCHMIDT J, et al. Cyclopentane fatty acids from Gibberellafujikuroi[J].Phytochemistry, 1992, 31(31):3 835-3 837.

[12]CROSS B E, WEBSTER G R. New metabolites of Gibberellafujikuroi. XV. N-jasmonoyl- and N-dihydrojasmonoyl-isoleucine.[J].Journal of the Chemical Society Perkin Transactions, 1970, 13(13):1 839-1 842.

[13]FARBOOD，MOHAMAD I，BLOCHER，et al. Production of food flavor-acceptable jasmonic acid and methyl jasmonate byDiplodiagossypinEP patent，EP1118672 A2[P].2001-07-25.

[14]韓曉敏, 梁良, 張爭,等. 可可毛色二孢菌對白木香產生倍半萜誘導作用[J].中國中藥雜志, 2014, 39(2):192-196.