全自動固相萃取-高效液相色譜測定蔬菜中滅蠅胺殘留

◎ 董　嬌，曹寧陽，耿　鑫

（1.沈陽產品質量監督檢驗院，遼寧　沈陽　110072；2.沈陽食品檢驗所，遼寧　沈陽　110136）

滅蠅胺（Cyromazine），化學名稱N-環丙基-1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺，是一種三嗪類有機化合物。滅蠅胺有很好的選擇性，主要對雙翅目類昆蟲有活性。其機理是使雙翅目類昆蟲幼蟲及其蛹在形態上發生畸變，成蟲羽化不全或受抑制。主要用于防治葉菜類、菜豆類和瓜果類的美洲斑潛蠅和潛葉蠅等農業害蟲。滅蠅胺以其高效、低毒性、低殘留、持效期長等特點，得到了世界范圍內的認可，目前已經廣泛應用于蔬菜蠅蛆的防治。GB 2763-2016《食品中農藥最大殘留限量》中規定滅蠅胺的限量指標：黃瓜中的最大殘留限量值為1.0 mg/kg，其他豆類蔬菜限量值為0.5 mg/kg。

目前，滅蠅胺檢測方法主要有HPLC法、HPLC-MS/MS法和GC-MS法，樣品前處理方法則基本都采用固相萃取法，而手動固相萃取操作存在自動化程度低、處理能力有限、重現性差等缺陷。本文采用全自動固相萃取儀進行萃取操作，相對于傳統的手動固相萃取方式，全自動固相萃取法降低了樣品用量，實現了樣品的自動化在線前處理，既節省了時間，又避免了操作人員直接接觸有機溶劑。同時，操作簡便，減少人為因素引入的誤差，重現性好，大大提高了分析效率。

1　材料與方法

1.1　儀器與試劑

儀器：島津LC20A高效液相色譜儀，配有M20A二極管陣列檢測器；Sepline-s1全自動固相萃取儀，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；HZF-A500電子天平，福州華志科學儀器有限公司；均質機，T18德國IKA公司；MV5多通道平行濃縮儀，北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

試劑：SCX固相萃取柱，6 mL，500 mg，上海安譜實驗科技股份有限公司；Florisil固相萃取柱，6 mL，500 mg，上海安譜實驗科技股份有限公司；滅蠅胺，純度98.0%，德國Dr .Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇，色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司；氨水、鹽酸，分析純，西隴化工股份有限公司；水，高純水。

1.2　實驗方法

1.2.1標準溶液的配制

滅蠅胺標準儲備溶液（100 mg/L）：準確稱取滅蠅胺標準品10 mg（精確至0.1 mg），置于100 mL容量瓶中，加入乙腈定容至刻度。分別吸取標準儲備溶液50 μL、100 μL、200 μL、0.5 mL、2.0 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容。配制成濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、2.0 μg/mL標準系列工作溶液[1]。

1.2.2樣品的預處理及提取

將蔬菜樣品取可食部分，擦去樣品表面的附著物，切碎，充分混勻，搗成勻漿。勻漿放入聚乙烯瓶中于-20～-16 ℃下保存。稱取樣品時，常溫樣品攪拌均勻，冷凍樣品解凍后混勻取樣。

稱取勻漿樣品20 g（精確至0.01 g）于250 mL三角瓶中，加入40 mL甲醇-水溶液(9∶1，V/V)，高速均質2 min，濾液經墊有濾紙的布式漏斗抽濾至100 mL具塞比色管中，再用25 mL上述混合溶液清洗燒杯和均質器刀頭，高速均質30 s，濾液經留有殘渣的布氏漏斗抽濾，合并濾液于100 mL具塞比色管中，加入8 mL 0.5 mol/L鹽酸，采用甲醇-水溶液(9∶1，V/V)定容，取出5 mL提取液至試管中待凈化[2]。

1.2.3提取液的凈化及濃縮

按表1中程序應用全自動固相萃取儀對樣品提取液進行凈化。凈化后的提取液在平行濃縮儀上40 ℃吹干，用流動相定容至1 mL。

表1　自動固相萃取凈化程序表

1.2.4HPLC分析條件

色譜柱，Thermo Hypersil APS2（NH2）氨基柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相，乙腈+水(97+3，V/V)；流速，1 mL/min；柱溫，30 ℃；進樣體積，10 μL；檢測器，二極管陣列檢測器；檢測波長，210 nm[3]。

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2　結果與討論

2.1　全自動固相萃取儀條件優化

2.1.1固相萃取柱的選擇

考慮到蔬菜樣品中含有較多色素，而滅蠅胺為三嗪類弱堿性化合物，所以本文選擇了Florisil小柱和SCX小柱對樣品進行凈化。實驗表明，SCX固相萃取柱對滅蠅胺的萃取效果較好，回收率較高，使用該型小柱所得萃取液干擾雜質較少。因為SCX固相萃取柱鍵含有苯磺酸官能團，所以上樣時，樣品溶液pH值會影響滅蠅胺在小柱上的吸附。本文通過在樣品提取液中加入8mL 0.5 mol/L鹽酸溶液，將提取液的pH值控制在2～3（不同基質pH值稍有差別），以保證其帶電荷，使滅蠅胺在洗脫之前能夠更好地保留在小柱上。Florisil小柱除去樣品中的色素效果明顯，但目標物滅蠅胺的回收率低于采用SCX小柱時所得到的結果。應用兩種固相萃取小柱凈化的方法檢出限沒有數量級上的差別。綜合考慮以上因素，本方法選擇SCX小柱作為凈化柱[4]。

2.1.2固相萃取條件優化

由于葉菜類和豆莢類樣品含有色素較多，當上樣量太大容易使小柱穿透，本方法選擇上樣體積為5 mL。應用SCX小柱進行凈化時，保持目標物帶有電荷可以更好地使目標物吸附在小柱上，有效提高回收率。實驗中對不同淋洗液的淋洗效果進行了比對，在其他條件相同的情況下，分別采用0.1 mol/L的鹽酸和純水作為淋洗液進行淋洗，對目標物回收率的影響并不明顯。同時，考慮到溶劑的環境友好性，最終選擇采用純水進行第一次淋洗，再用甲醇進行第二次淋洗，用以除去提取液中的極性干擾物質。SCX柱的洗脫液應為堿性溶液，一般為不同配比的氨水-甲醇洗脫液[5]。本文比較了5%的氨水-甲醇、10%氨水-甲醇、20%氨水-甲醇洗脫液，發現體積比為5∶95時洗脫效果較好，回收率高。應用5 mL上述5%的氨水-甲醇洗脫液，洗脫3次和洗脫兩次的回收率分別為86%和82%，為減少有機試劑的使用量，本文選擇5 mL 5%的氨水-甲醇洗脫兩次作為洗脫程序[6]。上樣流速和洗脫流速也會影響目標物回收率。上樣速度太快，樣品來不及與小柱作用就流出小柱，降低回收率。洗脫速度過快，洗脫溶劑沒有時間和目標物充分接觸，無法將樣品從小柱上充分洗脫下來，也會降低目標物回收率。本文充分考慮上述影響條件，確定上樣及洗脫的流速分別為1、2 mL/min[7]。

2.2　線性范圍及檢出限

將標準系列工作溶液按1.2.4色譜條件進行檢測，以對應的色譜圖峰面積為縱坐標（Y，響應值）、質量濃度為橫坐標（X，μg/mL）進行回歸分析。結果表明：滅蠅胺在濃度0.05～2.0 μg/mL呈良好的線性關系，回歸方程為Y=9.09e-006X+0.0075，線性相關系數（r）為0.9995。方法檢出限為0.02 mg/kg（信噪比RSN=3）。滅蠅胺的高效液相色譜圖，如圖1所示[8]。

圖1　濃度為1.0 mg/L的滅蠅胺高效液相色譜圖

2.3　加標回收率及精密度

選取黃瓜、土豆、豇豆3種蔬菜，按1.2.2及1.2.3進行加標實驗[9]。每種蔬菜選取中低高3個濃度，每個濃度分析6個樣品，每個樣品均應用手動和自動固相萃取兩種凈化方式，結果見表2。

表2　3種蔬菜回收率及精密度結果表

3　結論

參考文獻：

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