高效液相色譜法同時檢測配制酒中9種合成著色劑

◎ 劉子雄，劉映鑠，鄭鴻濤

（中山市食品藥品檢驗所，廣東　中山　528437）

配制酒是指以蒸餾酒、發酵酒或食用酒精為酒基，以食用動植物、食品添加劑作為呈香、呈味、呈色物質，按一定工藝加工而成，改變了其原酒基風格的飲料酒。其生產工藝允許添加一定量的著色劑改善其色澤，而合成著色劑因性質穩定，染色效果好，成本低廉易得，用量少等特點受到不少食品企業的青睞。但是，過量攝入合成著色劑會對人體健康造成一定的危害。因此，GB 2760-2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[1]對允許添加的合成著色劑使用量作了相關規定。

目前，合成著色劑主流檢測方法是高效液相色譜法，其中GB 5009.35-2016《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》[2]涉及7種著色劑的檢測，SN/T 1743-2006《食品中的誘惑紅、酸性紅、亮藍、日落黃的含量檢測 高效液相色譜法》[3]涉及4種著色劑的檢測，共包含9種合成著色劑，分別為檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、酸性紅（偶氮玉紅）和赤蘚紅。GB 5009.35-2016《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》中赤蘚紅的前處理方法與其他著色劑的前處理方法又不同，并不是利用聚酰胺粉吸附原理而是利用液液萃取進行處理，在日常檢測工作中，特別是大批量多項目合成著色劑檢測工作中，往往造成一個樣品多次前處理，分別檢測，給日常檢測工作帶來不便，不僅檢測時間大大延長，對檢測資源也造成一定的浪費。以下根據GB 5009.35-2016《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》、SN/T 1743-2006《食品中的誘惑紅、酸性紅、亮藍、日落黃的含量檢測 高效液相色譜法》和GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[4]的要求，參考有關文獻[5-7]，再結合日常檢測工作的經驗，利用聚酰胺粉吸附原理，對配制酒中合成著色劑進行提取和凈化，使用高效液相色譜儀和二極管陣列檢測器同時進行9種合成著色劑的檢測。

1　實驗部分

1.1　儀器和試劑

儀器：安捷倫1260高效液相色譜儀，G1315D 1260DAD檢測器；Milli-Q Integral 3 System純水系統；SSW-600-2S型電熱恒溫水槽；SHB-ⅢA循環水式多用真空泵。

試劑：標準物質檸檬黃（純度95.5%）、新紅（純度89.0%）、莧菜紅（純度92.8%）、胭脂紅（純度98.2%）、日落黃（純度90.5%）、誘惑紅（純度86.3%）、亮藍（純度92.3%）、酸性紅（純度93.5%）、赤蘚紅（純度91.0%），均由德國Dr.Ehrenstorfer公司提供；色譜級甲醇（默克）和乙酸銨（阿拉丁）；分析純甲醇，甲酸，無水乙醇，氨水，檸檬酸；層析用聚酰胺粉100～200目；一級水；配制酒試樣，購自超市。

1.2　溶液的配制

標準溶液按GB 5009.35-2016方法要求配制，固體純品型標準品需根據純度折算濃度。pH=5的甲醇-水（V∶V=6∶4）：量取分析純甲醇60 mL，純水40 mL，混勻，然后用甲酸調節pH到5。乙醇-氨水-水（V∶V∶V=7∶2∶1）：量取乙醇70 mL，氨水20 mL，純水10 mL，混勻。檸檬酸溶液：稱取20 g檸檬酸，加水溶解并稀釋至100 mL。pH=5的水：水中加檸檬酸溶液調pH到5。乙酸銨溶液（0.02 mol/L）：稱取1.54 g乙酸銨，加水溶解并稀釋至1000 mL。

1.3　樣品前處理

稱取樣品10 g（精確至0.001 g）至200 mL燒杯中，加水約40 mL混勻，用pH=5的水調節pH至酸性，置于60 ℃電子恒溫水浴鍋中，加入約1 g聚酰胺粉，攪拌。靜置至上層水溶液呈無色透明時，趁熱將樣品溶液倒入G3垂融漏斗中抽濾，用pH=5的水洗滌3次，每次10 mL，然后用pH=5的甲醇-水洗滌3次，每次10 mL，棄洗滌液。換干凈的抽濾瓶，用乙醇-氨水-水解吸3～5次，每次10 mL，直至色素完全解吸，收集解吸液至200 mL燒杯中，置于80 ℃電熱恒溫水槽中濃縮至約2～3 mL，加水定容至10 mL，經0.45μm PTFE微孔濾膜過濾，使用高效液相色譜儀分析。

1.4　色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipae Plus C18（4.6×250mm 5-Micron）。流動相：色譜甲醇（A）和0.02 mol/L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫，見表1。流速：1.000 mL/min。柱溫箱溫度：35 ℃。進樣量：10 μL。DAD檢測波長：亮藍檢測波長為575 nm，其他為480 nm（波長變動時間設置為0～8.20 min，480 nm；8.21～8.57 min，575 nm；8.58～10.05 min，480 nm）。

表1　梯度洗脫條件表

2　結果

2.1　方法的線性和檢出限

在設定的色譜條件下，9種合成著色劑色譜分離情況如圖1所示，線性方程及相關系數見表2。在本實驗條件下，按照信噪比S/N=3計算檢出限，結果見表2。

圖1　混合標準溶液色譜圖

表2　9種合成著色劑的線性方程、相關系數和檢出限表

2.2　方法的準確度

方法準確度用樣品加標回收率表示，對試樣進行3個濃度水平加標，每個水平進行3次重復測定，結果見表3。

表3　9種合成著色劑加標回收率表

2.3　方法的精密度

方法精密度用相對標準偏差表示，自制含有9種著色劑的配制酒試樣，進行7次重復測定，計算精密度，結果見表4。

表4　9種合成著色劑的方法精密度表（n=7）

3　討論

3.1　波長的選擇

GB 5009.35-2016和SN/T 1743-2006方法均采用254 nm作為檢測波長，但是在實際檢測過程中，特別是基質較復雜的樣品，容易造成干擾，出現假陽性，而且亮藍在254 nm處響應也較低。亮藍波長選擇為575 nm，響應明顯提高，其他著色劑波長選擇為480 nm，基質干擾明顯降低。

3.2　淋洗液的選擇

GB 5009.35-2016和SN/T 1743-2006方法均選擇甲醇-甲酸（V∶V=6∶4）作為其中一種淋洗液。實驗發現，由于酸性過強，當以甲醇-甲酸淋洗吸附有赤蘚紅的聚酰胺粉后，赤蘚紅被一并洗脫下來，回收率基本為零。故本方法對淋洗液進行了優化，把甲醇-甲酸更換成pH=5的甲醇-水，赤蘚紅的回收率顯著提高，滿足定量要求。

4　結語

通過線性、檢出限、準確度及精密度等方法確認，本方法符合檢驗要求，重現性好，結果準確可靠，并且節省了檢測時間和資源，可用于配制酒中合成著色劑的定量檢測。

參考文獻：

[1]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.GB 2760-2014 食品安全國家標準 食品添加劑使用標準[S].北京：中國標準出版社，2014.

[2]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.GB 5009.35-2016 食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定[S].北京：中國標準出版社，2016.

[3]國家質量監督檢驗檢疫總局.GB SN/T 1743-2006食品中的誘惑紅、酸性紅、亮藍、日落黃的含量檢測高效液相色譜法[S].北京：中國標準出版社，2006.

[4]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.GB/T 27404-2008 實驗室質量控制規范 食品理化檢測[S].北京：中國標準出版社，2008.

[5]戚榮平，夢 琪，桑 嫻，等.聚酰胺粉吸附-高效液相色譜法測定蜜餞中合成著色劑[J].中國衛生檢驗雜志，2015，25（10）：1525-1527.

[6]吳曉紅，蔣彩云，胡文彥，等.高效液相色譜法測定配制酒中6種人工合成色素[J].釀酒科技，2014（5）：102-104.

[7]王 鋒.超高效液相色譜法測定調味料中新紅、酸性紅、赤蘚紅的含量[J].上海計量測試，2013（2）：35-40.