乳酸菌國家檢驗標準的更新

◎ 許再元

（中國廣州分析測試中心，廣東　廣州　510070）

乳酸菌是一群能發酵碳水化合物產生乳酸的革蘭氏陽性細菌的通稱。目前，已發現的乳酸菌可以劃分為43個屬，包括373個種及亞種，其中絕大多數是厭氧菌或兼性厭氧菌。乳酸菌能寄生在人類、動物和植物中，其在發酵過程中的關鍵代謝產物是乳酸，當與其他代謝產物一塊作用于人體時，可對人體健康起到有益的作用，所以在各類食品中，如酸奶、干酪、肉類、巧克力和各類保健藥品中乳酸菌得到了廣泛的應用[1]。在食品國家安全檢測中GB4789.35-2010一直是乳酸菌檢測的標準，最近更新為GB4789.35-2016版本，可見乳酸菌在人們日常食品生產、消費中起到重要作用。

1　乳酸菌國家標準檢驗的更新

根據乳酸菌檢測國家標準，選用一個酸奶樣品進行新舊標準整個實驗流程的對比試驗，使用的舊版為GB4789.35-2010，使用的新版為GB4789.35-2016。對所得試驗結果和實驗過程中的現象進行對比，分析新舊版標準的不同與改版的目的。

1.1　培養基的配制及對比

培養基的配制部分，改變并不大，主要使用了MC培養基、MRS培養基以及改良MRS培養基，其中新版的改良MRS培養基里多添加了半胱氨酸[2]。半胱氨酸是一種生物體內常見的氨基酸，也是一種還原劑?？紤]到雙歧桿菌嚴格厭氧的特性，半胱氨酸不但可以作為營養成分以供菌株培養，同時作為一種保護劑保護菌株防止其因氧氣影響生長。

1.2　實驗主要操作流程及對比

第一步依然是將樣品用生理鹽水稀釋，然后接種到3種不同的培養基中，培養過后根據公式計數，最后選做鑒定。第一步稀釋并沒有改動，而在接種部分，2010版使用的是涂布0.1 mL的做法[3]，而2016版則使用1 mL傾注的方法[3]。在培養時間上，2010版的為（48±2）h，而2016版的則延長至（72±2）h[2-3]。就涂布與傾注而言，傾注法更為省事，但要求培養基的溫度不能太高，需要控制在（46±1）℃，傾注法能將培養基包裹，使樣品更好地隔絕空氣，讓改良MRS中的莫匹羅星鋰鹽更好地起到抑制乳桿菌的作用，加上半胱氨酸的保護作用，有助于雙歧桿菌的生長，且避免了涂布時出現的重疊不均勻等現象，可操作性更高。在取樣量上，1 mL比0.1 mL更有代表性，不確定度更低。至于因培養時間改變引起的區別主要在于對平板菌落計數的時候，如果平板菌落較多，培養時間延長至72 h，最終可能難以計數，而對于平板上菌落數量較少的情況并沒有太大影響。而在計數方面改動較大，將原來的公式從相減變為相加；同，2016版將根據樣品含菌的不同分別計數，整體彌補了前幾個版本在計數上的補足。而最后鑒定部分并沒有太大的改動。

1.3　計數實驗結果讀取及對比

以某品牌酸奶為例，分別按照國標2010版與2016版進行實驗，實驗部分結果，分別見表1、2。

表1　10-5稀釋度下10個平板的菌落數表

表2　10-6稀釋度下10個平板的菌落數表

用T-test進行數據分析，10-5稀釋度的P值為0.000048＜0.01，為極顯著差異。10-6稀釋度的P值為0.28＞0.05，無顯著差異。

通過對平板上菌落數數據分析以及實驗操作過程的分析，可以得到以下結果：在相同稀釋度下，稀釋倍數越低，平板菌落數越多，傾注法的菌落數量顯著比涂布法多。分析其原因，主要在于2點：①傾注法平板同一點上由于立體的效果可出現多個菌落計數，同時在混合均勻的前提下不容易出現多個單菌落相連。②涂布法存在的堆疊、涂布棒損耗以及操作等因素，使得菌落數偏小。在相同稀釋度下，稀釋倍數越高，平板菌落數越少，傾注法的菌落數量與涂布法菌落數量相當，無顯著差異。因此，在樣品得到充分稀釋的前提下，在計數結果上，新標方法能較準確地得出結果。

1.4　乳酸菌鑒定及對比

對于選做鑒定部分，新標與舊標相似，都是在計數結束后在原有的平板上挑取3個以上單菌落進行鑒定。使用舊標的方法，由于是涂布于培養基表面，挑取單菌落十分方便可行，而使用新標的方法就相對比較麻煩了。由于是傾注到培養基里面，雖有部分菌落可長在平板表面，但要挑取多個菌落時往往需要挑開原有的培養基。同時，如果同一平板菌落數較多且分布比較密集，要挑取到單菌落就比較困難。在挑取單菌落后，同樣進行革蘭氏染色、生化鑒定等試驗。新舊標準同樣面臨相同的問題，對于比較復雜的樣品（含有多種乳桿菌），很難全部一次鑒定出來，如只按照標準所述的生化鑒定方法，則干酪乳桿菌干酪亞種與鼠李糖乳桿菌難以區分。

2　對乳酸菌檢驗的一些想法

對于2016新版乳酸菌檢驗的改變，筆者認為更為貼近客觀事實。但在最后鑒定部分依然還有商榷的地方，例如：為了更有效地進行鑒定，是否應該像GB4789.35-2016版雙歧桿菌鑒定一樣將計數與鑒定分離開來，如計數使用傾注法而鑒定使用涂布法。同時，對于產品的鑒定規定，只對使用單一菌種的產品進行鑒定[4]，而在生化鑒定方面，不只是規定使用表中生化試劑，而可以使用像API50CH這類商品化的生化試劑盒又或者微生物生化鑒定系統。除了生化鑒定，筆者認為還應添加分子生物學的方法進行鑒定，特別在鑒定細菌分類到種、亞種的時候，往往些許的變異就可以改變生化現象[5]。因此，引入像PCR、熒光PCR等分子方法十分重要，如16S rRNA基因間隔區（Intergenic Spacer Region，ISR）的序列分析技術[6]、限制性片段長度多態性分析技術（Re-striction FragmentLength Polymorphism，RFLP）、擴增片段長度多態性分析技術（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、DNA芯片技術、腸細菌基因間重復共有序列分析技術（Enterobacte-rial Repetitive Intergenic Consensus Sequences，ERIC）以及重復基因外回文序列分析技術（Repetitive Extragenic Palindromic Sequences，REP）等，這些方法在乳酸菌分類檢測方面都是有效可行的方法[1]。

參考文獻：

[1]張家超，孫志宏，劉文俊，等.適用于乳酸菌分類鑒定的分子生物學技術[J].乳業科學與技術，2009（2）：89-93.

[2]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局.GB4789.35-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2010.

[3]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局.GB4789.35-2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2016.

[4]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局.GB4789.34-2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗 雙歧桿菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2016.

[5]Booysen C，Dicks L M T，Meijering I.Isolation identification and changes in the composition of lactic acid bacteria during the malting of two different barley cultivars [J].International Journal of Food Microbiology，2002（76）：63-73.

[6]Parola P，Maurin M，Alimi Y，et al. Use of 16SrRNA gene sequencing to identify Lactobacillus casei in Septicaemia Secondary to a Paraprosthetic Eenteric Fistula[J].European Journal Clinical Microbiology and Infectious Diseases，1998（17）：203-205.