脾虛痰濕證代謝綜合征患者腸道菌群的定量研究及其意義

陳　碩，牛天慧，孟凡榮，馬建偉

代謝性疾病在我國及全球范圍內均廣泛流行并呈現明顯的上升趨勢。代謝綜合征(metabolic syndrome, MS)作為多種代謝紊亂的集合狀態，易導致心腦血管等多種重大慢性疾病的發生與發展。MS作為上述疾病重要“高?！币蛩丶啊扒捌凇睜顟B，對其進行深入研究意義重大。腸道菌群通過多種途徑參與機體能量代謝，在代謝性疾病發生、發展過程中的作用已得到越來越多的重視，成為深入了解代謝性疾病新的切入點和靶點。傳統醫學中與腸道菌群最直接相關的理論為脾胃學說，既往大量研究證實，“脾虛證”與腸道微生態紊亂密切相關[1]。而脾虛失運與MS發生、發展密切相關，為其關鍵所在[2-3]?，F代醫學認為胰島素抵抗為MS、糖尿病及肥胖癥等代謝性疾病的共同“土壤”，且相關研究表明，腸道菌群的失調參與糖尿病、肥胖癥等代謝性疾病的發生、發展[4-5]。故基于“脾虛理論”和“共同土壤學說”，本研究認為脾虛痰濕證MS患者存在腸道菌群失調并對其進行了初步研究。通過對腸道總菌屬及主要菌群進行定量分析，以對比中老年脾虛痰濕證MS患者、氣陰兩虛證患者和健康人腸道菌群數量差異，以從微生態角度探討脾虛痰濕證MS的可能病因，為MS的中醫辨證分型提供客觀依據，指導今后治療。

1　資料與方法

1.1一般資料收集2015年1月—5月于就診于空軍總醫院中醫科或內分泌科的脾虛痰濕證和氣陰兩虛證MS各40例患者的糞便標本，并選取同期30名健康體檢者的糞便標本為健康對照組。其中脾虛痰濕證組男27例，女13例；年齡(55.14±1.22)歲。氣陰兩虛證組男24例，女16例；年齡(55.74±1.56)歲。健康對照組男18例，女12例；年齡(54.50±1.45)歲。3組研究對象性別和年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2診斷標準參照MS 2013中華醫學會糖尿病分會診斷標準，中醫辨證分脾虛痰濕證、氣陰兩虛證，參照《糖尿病中醫防治指南》(2009版)、《中藥新藥臨床研究指導原則》(2002版)及臨床觀察制定[2-3]。

1.3納入與排除標準

1.3.1納入標準：①40～80歲，漢族，符合上述診斷標準的MS患者及常規檢查無異常，身體狀況良好的健康人群，性別不限；②近1個月內沒有使用過抗生素、益生菌、益生元或胃腸動力藥；③近1個月內無胃腸道疾病，如腹瀉、便秘等；④無免疫性疾病、肝膽疾病及內分泌疾病病史；⑤受試者知情，并自愿簽署知情同意書。

1.3.2排除標準：①排除標本留取過程中有明顯污染者或DNA提取不合格者；②合并其他可能引起腸道菌群改變的疾病者；③既往胃腸道手術者；④近4周有重大手術及其他應激情況者。

1.4儀器與試劑熒光定量PCR儀ABI7500 System、PCR擴增儀(美國Perkin Elmer公司)，凝膠成像分析系統、紫外分光光度計SmartSpecTM3000(美國Bio-rad)，SYBR熒光定量PCR試劑盒(大連TAKARA公司)，pGM-T克隆試劑盒(VT202)，質粒小提試劑盒(DP103)，DH5α感受態細胞(CB101, TIANGEN)，糞便基因組提取試劑盒(DP328)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209)，PCR mix，GeneGreen核酸染料(RT210)，引物由上海英俊生物技術有限公司合成。

1.5方法

1.5.1引物設計：根據16S rRNA V3序列設計各菌屬的特異性引物，核對相應菌屬特異性后進行引物合成。

1.5.2標準曲線構建：提取各菌群DNA，并采用紫外分光光度儀和1%瓊脂糖凝膠電泳對提取后的各菌群DNA進行純度和完整性的鑒定。以健康對照組糞便提取的菌群DNA為模版行普通PCR反應擴增，擴增產物經電泳鑒定合格后對各目標菌群DNA進行純化回收，隨后將純化回收的各菌群DNA裝入pGM-T載體構建重組質粒并轉化至DH5α感受態細胞，經藍白斑篩選得到陽性單克隆產物，后進行質粒抽提，質粒經測序驗證符合后，即可作為標準品質粒。測得各菌屬質粒濃度，利用Avogadro常數計算質粒拷貝數，作為標準品原液。對其做6～8個10倍梯度稀釋，進行Q-PCR擴增，得到標準曲線。

1.5.3實時熒光定量PCR反應：應用實時熒光定量PCR檢測系統對各樣本進行擴增和定量檢測。每次實驗均同時做兩個副孔并設陰性對照，反應結束后記錄各菌屬拷貝數。

2　結果

3組研究對象在腸道總菌群、球形梭菌、柔嫩梭菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌屬和大腸桿菌數量比較差異具有統計學意義(P<0.05)。脾虛痰濕證組腸道總菌群、雙歧桿菌、乳酸桿菌數量顯著低于健康對照組，腸球菌屬、大腸桿菌、球形梭菌、柔嫩梭菌數量顯著高于健康對照組(P<0.05)。脾虛痰濕證組雙歧桿菌數量顯著低于氣陰兩虛證組，大腸桿菌數量顯著高于氣陰兩虛證組(P<0.05)。氣陰兩虛證組總菌群數量低于健康對照組，腸球菌屬數量高于健康對照組(P<0.05)。見表1。

表1　3組研究對象的各菌屬細菌數量比較[M(Q)]

注：與健康體檢組比較，aP<0.05；與氣陰兩虛證組比較，cP<0.05

3　討論

MS在傳統醫學中無相應的病名，亦無系統論述，現代中醫學者根據其主要臨床表現多將其歸屬于中醫學“脾癉”、“肥滿”、“濕阻”、“眩暈”、“胸痹”、“消渴”等范疇?！鹅`樞·衛氣失常》篇中所述“肥滿”、“膏人”具有“多氣而皮縱緩，縱腹垂腴”的特點，而MS多存在腹型肥胖，故認為與此相對應[6]。綜合古集記載及文獻報道，多認為MS的基本病機為本虛標實，包括氣血陰陽的不同，多涉及肝、脾、腎3臟，標實亦有痰、濕、瘀、熱的差異。MS雖與諸臟腑功能失調有關，但與脾的關系最為密切，脾虛痰濕為其病機的關鍵所在，是其發生、發展的重中之重[2-3]。有學者認為痰濕是MS、糖尿病、肥胖等代謝性疾病的“溫床”，是多種代謝性疾病的主要高危因素[7-8]。既往研究同樣表明，MS的病位證素主要在脾，病性證素主要為痰濕，多有痰濕內盛的證候特點[9-10]。因此，脾虛痰濕是MS及多種代謝性疾病中醫證候的主要特征，本研究對MS脾虛痰濕證患者腸道主要菌群的定量研究發現，脾虛痰濕證患者無論在菌屬類型和菌群數量改變上均尤為明顯，提示脾虛痰濕的根源可能與菌群失調密切相關。MS不同證型間腸道菌群存在差異，也進一步說明中醫的“證”有其物質基礎。

“脾胃為后天之本，氣血生化之源”，傳統醫學的“脾胃”泛指整個消化系統，參與人體的能量吸收與轉化，其與腸道菌群最為直接相關，20世紀90年代已有學者提出兩者之間存在著密切的相應關系[1]。此后，中醫微生態學不斷被提出，并進行了逐漸深入的研究。從微生態角度對傳統醫學進行了多方面的闡述和分析，為中醫“證候”的研究提供了客觀依據，通過對“脾虛證”與腸道菌群相關性的研究，認為“脾虛證”與腸道菌群失調存在著密切的因果關系。劉佳等[11]觀察了脾氣虛、脾陽虛和脾陽虛兼脾氣虛證老年患者腸道菌群的多樣性差異，發現三者間腸道菌群結構存在顯著差異，且各有其特異性。動物實驗研究表明，采用“健脾”類方藥，如四君子湯、補脾益氣方、益元止瀉顆粒和參苓白術散可增加實驗小鼠腸道厭氧菌群數量，降低部分需氧菌數量，調節紊亂的腸道菌群[12-15]。并認為健脾止瀉顆粒的治療作用可能與其改善了小腸上皮細胞絨毛結構有關，而其結構的改善以腸道菌群穩態的恢復為前提[16]。健脾法能改善脾虛患者或大鼠失調的腸道菌群，從而改善脾虛證的主要癥狀，如乏力、納差、腹瀉等，提示健脾類方藥是通過改善脾虛證患者失調的腸道菌群而緩解其臨床癥狀，并最終達到治療疾病的目的。

總之，結合本研究及既往相關研究結果發現，MS以脾虛痰濕證為主，其本質可能與腸道菌群的失調相關，提示健脾除濕可以通過改善腸道菌群失調達到治療MS等多種代謝性疾病的目的。但由于本研究的局限性、中醫證候的復雜性、腸道菌群的多樣性以及既往研究的有限性，僅能初步證實MS脾虛痰濕證患者存在腸道菌群的失調，可能在MS的發生、發展及脾虛痰濕證的形成中起重要作用，但究竟是何種菌群起關鍵作用及其可能的作用機制均未明確，均有待進一步深入研究。

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