四株飼用芽孢桿菌的分離鑒定及其16S-rRNA的序列分析

柴 俊， 朱 麗， 宋泉芝， 劉旭川， 張以芳， 許 琳， 普岳紅*

（1.云南農業大學省畜產品加工工程技術研究中心，云南昆明650201；2云南農業大學動物科學技術學院，云南昆明650201）

芽孢桿菌（Bacillus），是一類能形成芽孢（內生孢子）的桿菌或球菌，為好氧或兼性厭氧的細菌，革蘭氏染色呈陽性。當外界環境發生改變時，菌體內的結構發生變化，經過前孢子階段，最終形成一個芽孢，對外界不良環境有很好的抵抗作用（劉秀花，2005）。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)等芽孢桿菌在生長過程中會產生多種活性物質，對致病菌或內源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用，因其無毒、無害，被農業部允許作為飼料的添加劑，經常被制成微生物添加劑，用于改善動物腸道功能、促進動物生長和預防疾病（Fouad 等，2017；龔福明等，2009；李佳，2009；李晶等，2008）。本試驗對引進的樣品進行芽孢桿菌的分離鑒定，為微生物飼料添加劑的研究和利用提供科學基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料 飼料樣品及DH5α大腸桿菌為云南農業大學動物科學技術學院動物微生物實驗室引進保存。

1.2試劑 高保真Taq聚合酶、pMD18-T載體、DH5α感受態細胞和各種內切酶均為TAKARA公司產品，細菌DNA基因組提取試劑盒、純化回收試劑盒、質粒制備試劑盒均購自Bioteke公司。1.3 分離培養及染色鏡檢觀察 樣品經80℃高溫處理10～15 min。用無菌生理鹽水稀釋后傾注入芽孢富集培養基中，37℃培養24 h，然后在LB固體培養基上劃線分離培養，37℃培養24 h后，挑取不同形態特征的單個菌落，進行純培養及涂片染色鏡檢觀察。

1.4生化鑒定 按 《伯杰細菌鑒定手冊》（第8版、第9版）中的方法對純培養細菌進行生理生化鑒定（Holt等，1994；布坎南等，1986）。

1.516S-rRNA擴增及測序 根據GenBank中芽孢桿菌的16S-rRNA的相關序列設計本研究的引物： 上游引物 PR：8-27 （5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’），下游引物 PF：1525-1541（5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’)，目的片段大小為1500bp左右。

細菌全DNA基因組的提取：取分離菌株的單個菌落在LB液體培養基中培養至細菌對數生長期，用BIOTEKE公司細菌DNA提取試劑盒按說明書步驟，提取細菌總DNA，提取的DNA產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測結果，并初步估計其DNA含量。

PCR體系與反應條件：反應體系為50 μL：DNA 模板 4 μL， 10×PCR Buffer 5.0 μL，Ex Taq（5 U/μL)0.5 μL，dNTP mixture 4.0 μL， 上下游引物（20 μM）各 1 μL，ddH2O 34.5 μL。 PCR 反應程序：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃1 min，72 ℃1.5 min，共30個循環；72℃10 min；4℃ 保存。PCR結束后，取5 μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測結果。

PCR擴增產物回收純化及克隆測序：參照BIOTEKE公司DNA純化試劑盒說明對PCR擴增的16S-rRNA產物進行純化回收。純化產物與pMD18-T載體連接構建重組質粒，將得到的重組質粒轉入到DH5α感受態細胞中，經氨芐抗性篩選、藍白斑篩選獲得陽性克隆，提取質粒。對重組質粒進行酶切和PCR鑒定，并將鑒定結果正確的重組質粒送TAKARA公司測序。

1.616S-rRNA同源性及系統發育樹分析 從GenBank中下載有關飼用微生物菌株及芽孢桿菌菌株的16S-rRNA代表序列作為參比序列。下載的序列信息見表1。利用DNAStar軟件對測得的序列及參比序列進行同源性比較。并利用ClusterX和Mega5.0構建系統發育樹，進行系統進化親緣關系研究（Baindara等，2013；Leite等，2013）。

2　結果與分析

從樣品中分離到4株芽孢桿菌，分別命名為YB-1、YB-2、YB-3、YB-4， 經表型特性及 16S-rRNA序列分析，YB-1為蘇云金芽孢桿菌、YB-2、4為枯草芽孢桿菌、YB-3為蠟樣芽胞桿菌。其特性結合描述如下：

表1　飼用微生物中芽孢桿菌代表菌株的參比序列

2.1菌落特征 細菌在普通瓊脂平板上，YB-1為白色圓形菌落，邊緣整齊，表面透亮，濕潤，光滑，中央隆起，黏稠，直徑2～5 mm；YB-2為白色滴狀菌落，邊緣不整齊，中央微隆起，表面無光澤，干燥，直徑0.5～1 mm；YB-3為白色滴狀菌落，邊緣整齊，中央隆起，表面光滑濕潤，清亮，黏稠，直徑1.5～2mm；YB-4為白色圓形菌落，邊緣不整齊，表面無光澤，干燥如毛玻璃樣，直徑0.5 mm。

2.2形態特性 挑取單個菌落涂片染色后光鏡下觀察，菌落為桿狀呈簇狀或散在存在的革蘭氏陽性細菌。在不利環境下，形成芽孢。

2.3生化鑒定結果 細菌的生化鑒定結果為：（1）4株分離菌的接觸酶、運動性、葡萄糖發酵、硝酸鹽還原、淀粉水解酶反應都呈應陽性；尿素水解酶、M.R試驗、吲哚試驗、卵磷脂試驗都呈陰性；（2）YB-2和YB-4分離菌的木糖、阿拉伯糖、甘露醇、V.P試驗、明膠液化試驗都是陽性；YB-1分離菌的木糖、阿拉伯糖、甘露醇、V.P試驗、明膠液化試驗都是陰性；YB-3分離菌的木糖、阿拉伯糖、甘露醇的試驗為陰性，V.P試驗、明膠液化試驗是陽性。生化試驗結果見表2。

2.3細菌16S-rRNA PCR擴增 4株菌株提取DNA，利用16S-rRNA引物PCR擴增，得到約1.5kb大小的目的片段，結果見圖1。

2.4重組質粒的PCR鑒定結果 將獲得的目的片段與pMD-18T載體連接，構建的重組質粒轉入DH5α感受態細胞中培養提取質粒，進行PCR鑒定，結果見圖2。

2.5重組質粒雙酶切鑒定結果 重組質粒用Bam HI、HindⅢ 進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，可見酶切后產生兩條帶，大小與預期相符，結果見圖3。

表2　生化試驗結果

圖1　四株芽孢桿菌的16S-rRNA基因擴增電泳圖

圖2　重組質粒及質粒PCR擴增電泳圖

圖3　重組質粒雙酶切電泳圖

2.616S-rRNA序列同源性及系統發育樹分析結果 根據 YB-1、YB-2、YB-3、YB-4 的 16S-rRNA的測序結果，進行BLAST序列比對分析和系統進化樹分析。采用MEGA5軟件，分析4株分離菌與飼用微生物中芽孢桿菌的參比序列，繪制系統進化樹（見圖4）。4株分離菌與系統進化樹遠端的側孢芽孢桿菌的的同源性分別為88.35%、88.83%、89.68%和87.87%，表明分離菌與其遺傳距離較遠。YB-2、YB-4與枯草芽孢桿菌類群的B.subtilis HE937219的同源性分別為99.91%和100%，均在99%以上，且處于同一分支上，表明YB-2、YB-4屬于枯草芽孢桿菌。YB-1與蘇云金芽孢桿菌類群的B.thuringiensis AM292315的同源性為99.17%，在99%以上，處于同一分支，表明YB-1屬于蘇云金芽孢桿菌。YB-3與蠟樣芽孢桿菌類群的B.cereus NC_016771同源性為100%，表明YB-3屬于蠟樣芽孢桿菌。

圖4　4個分離株16S-rRNA與5個參比序列構建的進化樹

3　討論

細菌芽孢對外界環境不利于菌體生長的環境，如高溫、過酸等環境有較強的抵抗力。本試驗在樣品處理初期就經過80℃的高溫處理，除去了共生繁殖體的細菌，只有芽孢菌存活下來，使得試驗在初期分離細菌的過程中簡化了試驗時間和步驟。

目前國內外常用的飼用微生物種類主要有乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌、放線菌、光合細菌等幾大類（Fouad 等，2017；龔福明等，2009；李佳，2009；李晶等，2008）；其中芽孢桿菌主要有側孢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌等。本研究從引進的飼料樣品中分離到的芽孢桿菌種類有枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽孢桿菌，都是常用于飼料中的芽孢桿菌，可為本地微生物飼料添加劑的進一步發展提供研究基礎。

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