丁酸梭菌緩解仔豬應(yīng)激防御大腸桿菌病

邢 帥， 朱 琪 ， 梁東梅 ，3， 王柳懿 ，3， 張迪 ，4， 秦順義 ， 喬家運(yùn)， 王文杰*

（1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津300384；2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津300381；3.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定071000）

隨著規(guī)?；?、集約化養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，仔豬21日齡斷奶已經(jīng)成為豬場(chǎng)常規(guī)飼養(yǎng)管理的一部分。由于早期斷奶，仔豬生理各個(gè)方面發(fā)育的不健全，抵抗外界的能力較差，容易受到疾病、環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)等應(yīng)激因素的影響，導(dǎo)致仔豬食欲降低、消化不良、腹瀉、生長(zhǎng)緩慢和抗病力差等問(wèn)題，嚴(yán)重的甚至死亡，直接影響斷奶仔豬的增重和成活率，并影響整個(gè)飼養(yǎng)期的生長(zhǎng)速度和飼料轉(zhuǎn)化率。飼料中添加益生菌可以改善仔豬的生產(chǎn)性能、提高三碘甲狀腺原氨酸、胰島素和甲狀腺素含量（高印等，2016)，緩解各種應(yīng)激帶來(lái)的不利影響。

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）又名丁酸梭狀芽孢桿菌、酪酸梭菌，是芽孢桿菌科、梭菌屬的一種產(chǎn)丁酸、乳酸和乙酸，革蘭氏陽(yáng)性厭氧桿菌。Liao等 （2015）研究表明丁酸梭菌是重要的益生菌。丁酸梭菌能促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，抑制有害菌生長(zhǎng)繁殖，維持腸道菌群的穩(wěn)定 （Nakajima等，1997），提高腸道屏障維護(hù)腸道健康 （Xu等，2013）。丁酸梭菌還具有營(yíng)養(yǎng)、防癌、抗腫瘤、抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能、改善動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)、提高機(jī)體免疫力的作用（王騰浩，2015）。研究表明，添加丁酸梭菌可有效提高日增重和飼料轉(zhuǎn)化率。Hayakawa等（2016）研究表明，添加丁酸梭菌可降低腹瀉率，劉秋玲等（2016）進(jìn)行了大腸桿菌對(duì)小鼠誘導(dǎo)免疫應(yīng)激模型建立成功，李?；ǖ龋?017）研究表明大腸桿菌可以誘導(dǎo)仔豬發(fā)生炎癥，但現(xiàn)在關(guān)于丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌感染斷奶仔豬的生產(chǎn)性能、血清生化指標(biāo)、抗應(yīng)激能力的影響的研究報(bào)道較少。因此，本試驗(yàn)通過(guò)在斷奶仔豬日糧中添加0.05%丁酸梭菌來(lái)探討其對(duì)大腸桿菌感染斷奶仔豬抗應(yīng)激能力的影響，為丁酸梭菌在仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 丁酸梭菌（凍干粉）購(gòu)自洛陽(yáng)瑞萊生物工程有限公司，活菌總數(shù)為1×1010cfu/g?；A(chǔ)飼料購(gòu)自于天津通和飼料有限公司，按照NRC（2012）標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)玉米-豆粕型飼料進(jìn)行配制。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì) 選取（21±2）日齡健康“東北民豬×巴克夏”斷奶仔豬20頭，隨機(jī)分為4組，每組5頭仔豬，標(biāo)記為對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組。對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ組為基礎(chǔ)日糧組，試驗(yàn)基礎(chǔ)飼料的組成和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組為丁酸梭菌組，在基礎(chǔ)日糧中添加了0.05%的丁酸梭菌，活菌總數(shù)為1×1010cfu/g。試驗(yàn)為期15 d，每頭仔豬為單籠飼養(yǎng)，自由飲水和采食，濕度為55%～70%，溫度為25～28℃。在試驗(yàn)進(jìn)行到第14天的時(shí)候進(jìn)行斷料不斷水，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅲ組攻毒大腸桿菌。24 h后進(jìn)行采血，分離血清進(jìn)行檢測(cè)。

表1　基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.3檢測(cè)指標(biāo) 試驗(yàn)在第1天和第15天時(shí)分別對(duì)仔豬空腹稱取初重和末重，每天記錄每頭仔豬的吃料、腹瀉、精神等情況。在飼養(yǎng)的第14天時(shí)進(jìn)行斷料不斷水進(jìn)行飼喂，飼養(yǎng)的第15天，進(jìn)行前腔靜脈采血，分離血清，在4℃下6000 r/min離心5 min，取上清液分裝于5 mL的離心管中，置-80℃的低溫冰箱保存，測(cè)定血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶（GGT）、谷草/谷丙（AST/ALT）、尿素（UREA）、肌酐（CREA）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB）、白蛋白/球蛋白（A/G）以及乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、皮質(zhì)醇（CORT）、血糖（GLU）含量。

1.4檢測(cè)方法 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、 堿性磷酸酶 （ALP）、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶（GGT）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）用速率法，總蛋白（TP）用雙縮脲法，白蛋白（ALB）用溴甲酚綠法，尿素（UREA）脲酶紫外速率法，皮質(zhì)醇（CORT）用電化學(xué)發(fā)光法，肌酐（CREA）用苦味酸法，儀器用羅氏601型生化儀進(jìn)行分析。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件錄入，然后用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的單因素方差分析（one-way ANOVA)，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＞0.05表示差異不顯著，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響 從表2可以得出丁酸梭菌組與基礎(chǔ)日糧組相比平均日增重和平均日采食量分別提高為39.03%和31.13%，差異顯著（p＜0.05）。料重比有所下降，但效果不顯著（P＞0.05），腹瀉率明顯降低。

表2　丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響

2.2丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬血清指標(biāo)的影響 由表3可知，對(duì)照組、試驗(yàn)組Ⅰ、試驗(yàn)組Ⅱ和試驗(yàn)Ⅲ組總蛋白、白蛋白、球蛋白和白球比各組間差異不顯著（P＞0.05）?？偟鞍锥∷崴缶M與基礎(chǔ)日糧組相比呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；對(duì)照組、試驗(yàn)組Ⅰ、試驗(yàn)組Ⅱ和試驗(yàn)組Ⅲ相比白蛋白變化不顯著；丁酸梭菌組與基礎(chǔ)日糧組相比，球蛋白呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；白球比丁酸梭菌組與基礎(chǔ)日糧組相比呈下降的趨勢(shì)。對(duì)照組、試驗(yàn)組Ⅰ、試驗(yàn)組Ⅱ和試驗(yàn)組Ⅲ的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶、肌酐、尿素含量差異都不顯著（P＞0.05）。

表3　丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬血清指標(biāo)的影響

2.3丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬抗應(yīng)激能力的影響從表4可知，乳酸脫氫酶試驗(yàn)組Ⅰ與對(duì)照組相比呈上升的趨勢(shì)，試驗(yàn)組Ⅲ與試驗(yàn)組Ⅱ相比升高39.95%，差異極顯著（p＜0.01），試驗(yàn)組Ⅲ與試驗(yàn)組Ⅰ相比升高41.20%，差異極顯著（p＜0.01），試驗(yàn)組Ⅱ和對(duì)照組相比差異不顯著 （P＞0.05）。肌酸激酶試驗(yàn)組Ⅰ與對(duì)照組相比升高，試驗(yàn)組Ⅱ與對(duì)照組相比降低24.42%，差異顯著（p＜0.05），試驗(yàn)組Ⅲ與試驗(yàn)組Ⅱ相比升高，試驗(yàn)組Ⅲ與試驗(yàn)組Ⅰ相比降低22.45%，差異顯著（p＜0.05）。皮質(zhì)醇試驗(yàn)組Ⅰ與對(duì)照組相比降低，試驗(yàn)組Ⅱ與對(duì)照組相比升高，試驗(yàn)組Ⅲ與試驗(yàn)組Ⅰ相比升高，試驗(yàn)組Ⅲ與試驗(yàn)組Ⅱ相比降低。血糖試驗(yàn)組Ⅰ與對(duì)照組相比升高，試驗(yàn)組Ⅱ與對(duì)照組相比降低，試驗(yàn)組Ⅲ與試驗(yàn)組Ⅰ相比升高，試驗(yàn)組Ⅲ與試驗(yàn)組Ⅱ相比升高44.60%，差異顯著（p＜0.05）。

表4　丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬抗應(yīng)激能力的影響

3　討論

3.1丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響 丁酸梭菌能夠產(chǎn)生乙酸、丁酸和乳酸，其能有效抑制腸道有害菌的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)能夠促進(jìn)腸道有益菌比如雙歧桿菌、乳酸桿菌的生長(zhǎng)繁殖，穩(wěn)定腸道微生態(tài)平衡。在生產(chǎn)實(shí)踐中，丁酸梭菌的應(yīng)用已經(jīng)取得了顯著的效果，其能夠提高動(dòng)物的抵抗力，減少動(dòng)物的死亡，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)效益（黃俊，2012）。 張秀江等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，仔豬斷奶后日糧中添加丁酸梭菌，試驗(yàn)組的腹瀉率極顯著低于對(duì)照組（p＜0.01）。張彩云等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬的日糧中添加丁酸梭菌，有利于提高平均日增重，飼料的轉(zhuǎn)化率得到改善，腹瀉率也有所降低?？紫闀?shū)等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌能夠提高日增重、降低料重比、改善生產(chǎn)性能。李玉鵬等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，添加丁酸梭菌料重比降低，平均日增重提高。這些與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致，添加丁酸梭菌提高了平均日增重和平均日采食量，降低了料肉比和腹瀉率。

3.2丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬血清指標(biāo)的影響 血清中總蛋白和白蛋白的含量增加是生物體蛋白質(zhì)代謝旺盛的體現(xiàn)，說(shuō)明機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)、氨基酸的吸收利用率是有所提高的，蛋白質(zhì)在肝臟的合成代謝作用增強(qiáng)以及組織中的蛋白質(zhì)沉積作用不斷加強(qiáng)，機(jī)體內(nèi)抵抗感染的重要蛋白就是球蛋白，其對(duì)免疫功能有很大影響，具有抗外毒素、抗病毒、抗細(xì)菌等作用。賈聰慧等（2016）發(fā)現(xiàn)添加丁酸梭菌組的肉雞血清總蛋白含量有明顯的升高 （p＜0.05)，免疫球蛋白有顯著的提升。王柳懿等（2017）研究表明在仔豬日糧中添加丁酸梭菌，能激活TLR2/4信號(hào)通路，啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答，提高機(jī)體的免疫力。這些與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致，丁酸梭菌組仔豬血清總蛋白明顯升高，而球蛋白跟總蛋白的趨勢(shì)一致，白球比明顯降低。白蛋白變化不明顯。說(shuō)明添加丁酸梭菌組總蛋白升高，機(jī)體代謝旺盛。

在動(dòng)物受到外界的應(yīng)激或者損傷時(shí)細(xì)胞的通透性會(huì)增加，存在動(dòng)物肝臟中的堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶就會(huì)進(jìn)入血液，血液中這三種酶的活性明顯增加。肝臟是否受損可以通過(guò)檢測(cè)堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性來(lái)判斷（朱孟玲等，2010）。動(dòng)物肝臟中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶是比較重要的轉(zhuǎn)氨酶，對(duì)動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的分解和非必需氨基酸的合成都起到了非常重要的作用（Song等，2004）。谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶是與仔豬蛋白質(zhì)的合成密切相關(guān)的，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶可促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成（吳偉等，2012）。血清中的尿素氮能夠反映動(dòng)物體內(nèi)的蛋白質(zhì)的合成代謝狀況以及日糧中氨基酸是否平衡。當(dāng)日糧中的含氮物質(zhì)增高，組織受到損害和動(dòng)物體氨基酸代謝加強(qiáng)時(shí)尿素氮就會(huì)升高。動(dòng)物體蛋白質(zhì)合成加強(qiáng)，尿素氮就會(huì)降低。血清中的γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶主要來(lái)源是肝細(xì)胞，肝臟受損γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)酶的活性明顯升高（賈曉燕等，2006）。本試驗(yàn)中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)酶、肌酐和尿素，試驗(yàn)Ⅲ組與試驗(yàn)Ⅱ組相比增高以及試驗(yàn)Ⅰ組與對(duì)照組相比增高。說(shuō)明攻毒大腸桿菌對(duì)仔豬肝臟產(chǎn)生了影響，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶和肌酐在試驗(yàn)Ⅲ和試驗(yàn)Ⅰ組相比降低，說(shuō)明丁酸梭菌對(duì)仔豬肝腎功能有一定的保護(hù)作用。

3.3丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬抗應(yīng)激能力的影響

動(dòng)物受到應(yīng)激時(shí)，衡量下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸（HPA軸）活性的方法是測(cè)定血清糖皮質(zhì)激素的濃度（李吳陽(yáng)等，2014)。皮質(zhì)醇是腎上腺皮質(zhì)分泌的 激 素 （Vebugghe 等 ，2012）。 Caroprese 等（2010）研究顯示如果母羊受到了應(yīng)激，HAP軸可以迅速的產(chǎn)生免疫應(yīng)答和母羊的機(jī)體在應(yīng)激條件下促進(jìn)被動(dòng)反應(yīng)。楊培歌等（2013）表明血液中的肌酸激酶和乳酸脫氫酶可以反映機(jī)體能量代謝。動(dòng)物受到熱應(yīng)激的時(shí)候，由于動(dòng)物供應(yīng)肌肉能量的不足，細(xì)胞受到了損傷，細(xì)胞膜的通透性增大，肌酸激酶從肌肉中溢出，導(dǎo)致血液中的肌酸激酶升高。在動(dòng)物受到應(yīng)激時(shí)，機(jī)體首先供應(yīng)心臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的氧氣，其他組織在無(wú)氧的條件下極有可能通過(guò)無(wú)氧酵解的方式進(jìn)行供能，這樣乳酸脫氫酶的含量就會(huì)升高。本試驗(yàn)表明肌酸激酶指標(biāo)在試驗(yàn)Ⅱ與對(duì)照組相比降低，并且試驗(yàn)Ⅲ與試驗(yàn)Ⅰ相比降低，差異都顯著（p＜0.05），說(shuō)明丁酸梭菌在肌酸激酶的指標(biāo)上起到了保護(hù)的作用；乳酸脫氫酶指標(biāo)在試驗(yàn)Ⅲ與試驗(yàn)Ⅰ相比升高并且試驗(yàn)Ⅲ與試驗(yàn)Ⅱ相比升高，差異都極顯著 （p＜0.01），說(shuō)明試驗(yàn)Ⅲ組在受到大腸桿菌感染時(shí)乳酸脫氫酶迅速升高進(jìn)而來(lái)緩解大腸桿菌帶來(lái)的應(yīng)激。皮質(zhì)醇四組相比差異不顯著但是攻毒大腸桿菌的試驗(yàn)組Ⅰ和試驗(yàn)組Ⅲ低于對(duì)照組和試驗(yàn)組Ⅱ，說(shuō)明攻毒大腸桿菌對(duì)仔豬的HPA軸活性起到了抑制作用；在應(yīng)激的條件下，動(dòng)物機(jī)體神經(jīng)興奮，腎上腺髓質(zhì)的分泌能力加強(qiáng)，致使腎上腺素升高，導(dǎo)致肝糖原分解，血糖升高，這是動(dòng)物應(yīng)激初期的表現(xiàn)（董淑麗等，2004）。血糖指標(biāo)在試驗(yàn)組Ⅲ與試驗(yàn)組Ⅱ比較和試驗(yàn)組Ⅰ與對(duì)照組相比較中都有所提高，說(shuō)明大腸桿菌對(duì)仔豬產(chǎn)生了應(yīng)激。血糖在試驗(yàn)組Ⅱ與對(duì)照組相比下降，試驗(yàn)組Ⅲ與試驗(yàn)組Ⅰ和試驗(yàn)組Ⅱ相比升高，試驗(yàn)組Ⅲ與試驗(yàn)組Ⅱ相比試驗(yàn)組Ⅲ升高差異顯著（p＜0.05）。說(shuō)明丁酸梭菌對(duì)仔豬感染大腸桿菌起到了明顯的適應(yīng)反應(yīng)?？傮w看來(lái)丁酸梭菌對(duì)仔豬感染大腸桿菌起到了保護(hù)作用。

4　結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧中添加丁酸梭菌可以提高仔豬的生產(chǎn)性能，增加總蛋白的水平，改善肝腎的功能，有效緩解仔豬大腸桿菌病引起的應(yīng)激。

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