2017年325個規模豬場7種病毒類疾病病原監測數據分析與2018年防控建議

夏 偉，牟 迪，唐志芬，石微琳，王子敬，趙偉男，申 婧，劉文娜，段 紅，閆 平，于海波，朱慶虎

（哈爾濱維科生物技術開發公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

2017年1—12月份，哈獸維科市場技術服務部檢測實驗室共收到全國325個規模豬場的1 079份病料（肺臟、脾臟和淋巴結等）樣品和425份糞便或腸道樣品。采用PCR和RT-PCR等分子生物學方法對7種病毒類疾病病原如豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬圓環病毒2型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）、傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（PoRV）等進行檢測。通過對檢測數據進行整理和統計分析得知，PEDV陽性檢出率（174/425）40.94%，PCV2陽性檢出率（233/837）27.84%，PRRSV陽性檢出率（279/1 027）27.17%，PRV陽性檢出率（75/899）8.34%，PoRV陽性檢出率（20/357）5.60%，CSFV陽性檢出率（21/919）2.29%，TGEV陽性檢出率（1/386）0.26%。其中PEDV、PCV2、PRRSV、PRV及PoRV等5種病原檢出率較高，是危害規模豬場的常見病原。第一、二、四季度保育豬慢性消瘦和呼吸道病嚴重病例PRRSV、PCV2檢出率高，斷奶保育期豬群難養，發病率高，死淘率高。第一、二和四季度哺乳仔豬暴發腹瀉病例PEDV檢出率高，造成哺乳仔豬死亡率升高，生長緩慢等。通過臨床調查和數據分析得知，進入冬季，氣溫下降后豬群PED（豬流行性腹瀉）發病率顯著上升，豬場各生理階段豬群均有典型腹瀉病例，并且發生PED豬群很難根治。而PCV2與PRRSV協同感染及與其他病原混合感染，PRRSV毒株多樣性是目前疫病防控的難點。總之，2018年我國規模豬場仍要把 PEDV、PCV2、PRRSV、PRV 及 PoRV 等 5種病毒類疾病病原作為防控重點，建議豬場加強病原與血清監測，不斷提高對疾病的認識和科學使用疫苗，完善生物安全措施，精準用藥和避免防疫誤區。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及分布

樣品來源于全國24個省市，樣品包括肺臟、脾臟和淋巴結等組織以及腸道內容物和糞便，通過調查了解豬場免疫背景和臨床發病情況以及剖檢典型發病豬取組織樣品，-20℃冷凍送檢（圖1）。

圖1 樣品分布（圓圈代表樣品來源區域）

1.2 主要試劑和儀器

PCR和RT-PCR擴增試劑盒、飽和酚、TaqDNA聚合酶、dNTPs、EB、DEP水、TRIZOL（總 RNA 抽提試劑，主要成分苯酚等）、DL 2 000 Marker、TaKaRaRNAPCRKit（AMV）Ver.3.0均購自寶生物工程（大連）有限公司。生物安全柜、分析天平、高速離心機、迷你掌上離心機、渦旋振蕩器、PCR擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀、冰箱、微波爐、水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋等。

1.3 引物設計與合成

根 據 GenBank 登 陸 的 PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、PEDV、TGEV、PoRV的基因序列，用 Oligo6.0軟件設計引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成。引物序列見表1。

1.4 樣品處理及核酸提取

按檢測需求分別對取肺臟、脾臟、淋巴結樣品混合，對腸內容物和糞便混合用研磨器充分研磨，利用MEM營養液進行10倍稀釋，然后利用DNA和RNA提取試劑盒進行核酸抽提。

1.5 病毒核酸檢測

1.5.1 PRRSV、CSFV、PEDV、TGEV、PoRV 的擴增分別用BIOZOL總RNA提取試劑盒（博日公司）從病毒培養液提取總RNA為模板，采用TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）試劑盒進行RT-PCR擴增，反應條件 RT：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；PCR：（94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min）×35個循環，72 ℃延伸7 min，PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 用于PCR和RT-PCR反應的引物

1.5.2 PRV、PCV2的擴增分別用天根生物科技有限公司DNA提取試劑盒，從病毒培養液提取DNA為模板，采用TaKaRa One Step DNA PCR Kit試劑盒進行PCR擴增，反應條件94℃ 2 min；（94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min）×35個循環，72 ℃延伸 10 min，PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結果與分析

（1）2017年對24個省325個規模豬場送檢1 079份肺臟、脾臟和淋巴結等組織樣品與425份腸道內容物、糞便等樣品，分別進行了PEDV、PCV2、PRRSV、PRV、PoRV、CSFV、TGEV 等 7種病原的檢測。結果顯示，PEDV陽性檢出率（174/425）40.94%，PCV2陽性檢出率（233/837）27.84%，PRRSV陽性檢出率（279/1 027）27.17%，PRV陽性檢出率（75/899）8.34%，PoRV 陽性檢出率（20/357）5.60%，CSFV陽性檢出率（21/919）2.29%，TGEV陽性檢出率（1/386）0.26%，7 種病原中 PEDV、PCV2、PRRSV、PRV 4種病原檢出率明顯高于其他3種病原，其中TGEV檢出率最低（如圖2）。

圖2 2017年全年各常見病毒檢出率統計

（2）2017年送檢樣品中PEDV在第一、二、三、四季度的檢出率分別為48.48%、61.22%、14.43%、39.69%，其中第一、第二、第四季度是PEDV高發期，第三季度PEDV檢出率最低。PCV2在第一、二、三、四季度檢出率分別為26.74%、27.98%、28.05%、28.27%。PCV2的檢出率四個季度均較高，其危害基本不受季節影響。PRRSV在第一、二、三、四季度檢出率分別為 25.88%、27.65%、25%、29.12%。PRRSV在四個季度均有較高檢出率，第四季度檢出率高于其他三個季度。PRV在第一、二、三、四季度的檢出率分別為5.44%、8.33%、6.48%、11.54%。相對于前三季度，第四季度PRV的檢出率較高。從數據統計看第四季度和第一季度，秋冬春季節環境冷應激會影響豬群體質，4種病原檢出率相對較高（如圖 3）。

圖3 不同季度PEDV、PCV2、PRRSV、PRV 4種病毒檢出率動態變化

（3）對233份PCV2抗原陽性樣品統計PCV2單獨感染和PCV2與PRRSV、PRV、PEDV等混合感染情況。其中PCV2單獨感染檢出率最高（48.50%）,PCV2與PRRSV混合感染檢出率37.34%，PCV2與PRV混合感染檢出率為6.44%（如圖4）。

圖4 2017年1—12月PCV2與其他病毒混合感染變化

（4）對279份檢測到PRRSV陽性樣品統計PRRSV單獨感染和PRRSV與PCV2、PRV、PEDV等病原混合感染情況。PRRSV與PCV2混合感染檢出率為31.18%，PRRSV單獨感染檢出率為54.48%（如圖5）。

圖5 2017年PRRSV與其他病毒混合感染變化

（5）比較2016年與2017年7種病原檢出率的變化顯示，CSFV檢出率由2016年的1.45%上升至2017年的2.29%；PRRSV檢出率由2016年24.96%上升至2017年的27.17%；PCV2檢出率由2016年的35.90%下降為27.84%；PRV的檢出率由2016年的16.86%下降為8.34%；PEDV檢出率由40.98%下降到40.94%；TGEV檢出率由2016年同期的3.05%下降到0.26%；PoRV檢出率由2016年同期4.84%上升到5.60%（如圖6）。

圖6 2016年與2017年7種病原陽性檢出率對比變化

3 討論

（1）2017年通過325個規模豬場的1 079份病料（肺臟，脾臟和淋巴結等）樣品和425份糞便或腸道樣品。采用PCR和RT-PCR方法對常見7種病毒類疾病病原檢測和數據統計分析得知，PEDV陽性檢出率（174/425）40.94%，PCV2陽性檢出率（233/837）27.84%，PRRSV陽性檢出率（279/1 027）27.17%，PRV陽性檢出率（75/899）8.34%，PoRV陽性檢出率（20/357）5.60%，CSFV陽性檢出率（21/919）2.29%，TGEV陽性檢出率（1/386）0.26%，7種病原中PEDV、PCV2、PRRSV、PRV等4種病原檢出率明顯高于其他3種，其中TGEV 檢出率最低。PEDV、PCV2、PRRSV、PRV 及PoRV等5種病原仍是危害規模豬場的常見病原。CSFV、TGEV 2種病原檢出率較低，說明豬場控制的較好。

（2）通過對豬場背景調查和檢測數據分析得知，第一、二、四季度斷奶保育期間慢性消瘦和呼吸道病嚴重病例送檢PRRSV和PCV2檢出率相對較高，PRRSV和PCV2病原陽性場斷奶到生長期豬群難養，均勻度差，死淘率高；第一季度、第二季度和第四季度哺乳仔豬暴發腹瀉病例PEDV檢出率高，造成哺乳仔豬和斷奶仔豬嚴重腹瀉，死亡率高，生長緩慢等。可見秋季、冬季和春季3個季節因氣溫下降和晝夜溫差大等環境因素導致豬體抗病能力下降容易感染PEDV、PRRSV、PCV2、PRV 等病原。所以，氣溫下降前應加強豬場保溫設備投入和強化免疫評估等措施應對疾病威脅。

（3）統計7種病原混合感染情況得知，PRRSV與PCV2的共感染現象最為嚴重，另外PCV2、PRRSV單獨感染的情況也比較普遍，PCV2、PRRSV與PRV的混合感染也占有一定的比例，PEDV與PRRSV、PRV、PCV2的混合感染病例要引起重視。建議豬場科學合理安排PCV2、PRRSV、PRV等病原的疫苗免疫注射工作和生物安全措施，引種要慎重。

（4）比較2016年與2017年7種病原CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PEDV、TGEV、PoRV 陽性檢出率，其中PRRSV、CSFV、PoRV等 3種病原檢出率升高，而PCV2、PEDV、PRV、TGEV、PoRV 等 5 種病原檢出率略有下降。

（5）對檢測PRRSV的樣品，要求描述臨床癥狀并剖檢取肺臟病變部位、脾臟和淋巴結混合作為檢驗樣品，采用RT-PCR方法，不同引物檢測能區分經典株、變異株和類NADC30株，但做數據統計時不同毒株的陽性樣品均判定PRRSV陽性。從送檢單位反映的信息和實驗室的檢測結果分析得知，PRRSV的不同毒株在臨床上均有致病性，生長豬感染后會表現不同程度的發燒、咳喘、消瘦、生長抑制、精神沉郁，剖檢以肺臟病變為主，部分樣品來自早產和正常分娩所產死胎。PRRSV導致的母豬繁殖障礙與斷奶后生長豬的呼吸道病仍是臨床常見的表現形式。檢測PRV的樣品主要以發病豬腦為主，臨床上表現典型神經癥狀，如肌肉震顫，精神沉郁，口吐白沫等哺乳仔豬和保育豬發病為主。部分豬場暴發時以母豬流產、早產、死胎等，保育豬神經癥狀和育成豬嚴重呼吸道病為典型臨床表現。剖檢后腦出血病變嚴重。選用合適的引物，通過PCR方法檢測特異性好，敏感度高。檢測PCV2的樣品主要為淋巴結和脾臟等免疫器官為主。因PCV2感染豬體免疫器官造成白細胞水平下降，機體免疫機能下降，在臨床上表現斷奶后仔豬至生長豬階段慢性消瘦、生長抑制以及與PRRSV等病毒和細菌感染增加此階段豬死淘率。臨床PCV2疫苗應用廣泛，但因疫苗品質和免疫方法不正確導致免疫效果不理想，臨床樣品檢出率較高。檢測PEDV、TGEV、PoRV等病毒的樣品只要來自腹瀉豬的糞便和小腸內容物，采用RT-PCR方法檢測特異，敏感，方法可靠，也可以采取膠體金的方法檢測。PEDV感染發病急，傳播快，哺乳仔豬死亡率高為典型特征。通過檢測發現PED流行已經無明顯季節性特征，并且臨床上感染各生理階段豬群。所以，豬場要加強群體免疫和全年免疫的理念，做好保溫、消毒及營養等措施能降低發病率和發病死亡率。

4 免疫建議（僅供參考）

4.1 豬瘟兔化弱毒疫苗

種公豬/母豬一年普免3～4次，2頭份/頭，或母豬產后21天跟胎免疫2頭份/頭；仔豬28～35日齡首免2頭份/頭，56～63日齡二免2頭份/頭；后備豬配種前免疫1次，2頭份/頭。

4.2 豬偽狂犬病活疫苗

種公豬/母豬一年普免3～4次，2頭份/頭，仔豬1～3日齡滴鼻1頭份/頭（PRV-gE抗體陰性的豬場可不滴鼻），45～55日齡二免2頭份/頭，90～100日齡三免2頭份/頭。

4.3 豬圓環病毒2型滅活疫苗

種公豬/母豬一年普免3～4次（產前15天至分娩慎重免疫），2毫升/頭，或者母豬產前30天，產后14天加強免疫2毫升/頭，仔豬7～14日齡首免1毫升/頭，28～35日齡二免1毫升/頭，斷奶仔豬和保育中后期出現典型斷奶后多系統衰竭綜合征（PMWS）問題應在發病前2～3周建立堅強免疫。

4.4 豬流行性腹瀉疫苗

種公豬/母豬8月份1年普免1次腹瀉三聯活疫苗，1頭份/頭，間隔3周加強免疫，過30天對產前40～50天妊娠母豬免疫1頭份/頭，產前20～30天加強免疫1頭份/頭（建議常年跟胎次免疫）；分娩前10～15天免疫PED滅活疫苗4毫升/頭，仔豬斷奶時免疫1頭份/頭，后備豬配種前免疫2次，1頭份/頭，間隔21天加強免疫。