牡丹峰地區(qū)東北林蛙肌肉重金屬含量分析與評價

田新民 ，石蘭英，喬征磊，劉長海，王 淼

東北林蛙（Rana dybowskii）隸屬于蛙科林蛙屬，主要分布于中國亞寒帶的東北三省和內(nèi)蒙古自治區(qū)，是重要藥用價值林蛙油的主要來源，也具有較高的營養(yǎng)食用價值，為東北林區(qū)重要經(jīng)濟(jì)物種［1，2］。 近年來工農(nóng)業(yè)活動，使土地和河水受到污染，特別是重金屬的污染［3］，被蛙類等生物體吸收和富集，通過食物鏈進(jìn)入人體，危害健康［4，5］。 因此有必要進(jìn)行蛙類棲息環(huán)境、養(yǎng)殖條件及食用部位重金屬評價領(lǐng)域的研究，而此領(lǐng)域主要集中在魚類的研究［3，6］。

關(guān)于東北林蛙的研究，近些年在雌性林蛙油和營養(yǎng)價值等領(lǐng)域進(jìn)行了深入研究，為林蛙保健食品的開發(fā)提供了重要的參考數(shù)據(jù)［7－10］，而對有害重金屬含量的分析鮮有報道。牡丹峰國家級自然保護(hù)區(qū)距牡丹江市中心僅15 km，易受城市活動的影響。該區(qū)域內(nèi)已開展多年的東北林蛙半人工養(yǎng)殖，同時建有林蛙儲存庫，是牡丹江市場重要的林蛙源。因此，有必要開展該地區(qū)東北林蛙重金屬評價的研究，為東北林蛙的合理養(yǎng)殖和食品開發(fā)利用提供重要參考。

1　材料與方法

1.1　研究地區(qū)概況

牡丹峰國家級自然保護(hù)區(qū)位于黑龍江省牡丹江市區(qū)東南約15 km處，地處老爺嶺山脈西北端，東與太平嶺相接，西與張廣才嶺比鄰。以保護(hù)牡丹峰珍貴的山地云冷杉、紅松闊葉混交林及生物多樣性資源為目的，總面積194.68 km2。保護(hù)區(qū)內(nèi)有5種國家Ⅰ級和32種國家Ⅱ級重點(diǎn)保護(hù)動物，也是東北林蛙的主要分布區(qū)，林蛙主要以半人工方式養(yǎng)殖。保護(hù)區(qū)內(nèi)的煙囪河為東北林蛙主要的越冬場所，是蛙卵人工孵化池的水源，并且中游段建有東北林蛙儲存庫［11，12］。

1.2　試驗材料

于2016年4月，沿?zé)焽韬由稀⒅小⑾掠胃浇鼘Χ叱鱿U后的東北林蛙進(jìn)行捕捉，同時取三個段位的河水備用分析。東北林蛙的體長與年齡密切相關(guān)，根據(jù)體長鑒定年齡［13］，將捕獲的林蛙測定體長（精確到0.01 mm），鑒定得到一齡、二齡、三齡個體（其中四齡個體較少，歸到三齡個體中分析）。因林蛙肌肉為人們常食用部位，故本研究僅以肌肉為分析樣本，解剖獲得腿部骨骼肌樣品備用。每個年齡段雌雄各10份樣品，共60份。

1.3　試劑與儀器

硝酸為高級純，過氧化氫為優(yōu)級純，標(biāo)準(zhǔn)品購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。7700 Series電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP－MS，Agilent Technologies），MDS－10 微波消解儀（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司）。所用玻璃及聚四氟乙烯儀器均用5%硝酸溶液浸泡24 h以上，然后用去離子水沖洗，晾干后備用。

1.4　微波消解法

稱取已處理的肌肉樣0.5 g置于聚四氟乙烯微波消解罐中，加入8 mL HNO3（65%～68%）預(yù)處理20 min，補(bǔ)加 2 mL HNO3和 1 mL H2O2（30%）消解。 消解條件：130℃ 25 min；150 ℃ 10 min；200 ℃ 25 min，單罐功率均為400 W。消解冷卻后，將聚四氟乙烯微波消解罐置于平板加熱器上除酸，最后用去離子水定容至25 mL。7700 Series ICP－MS測定重金屬濃度，最后換算為每千克肌肉樣品含多少毫克的元素。

1.5　數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差；選擇單因子方差分析（One－way ANOVA）進(jìn)行河水不同河段之間重金屬含量的差異顯著性檢驗和不同年齡段間重金屬含量的差異顯著性檢驗；應(yīng)用Pearson相關(guān)分析評價重金屬與體長間、重金屬間的相關(guān)性；相關(guān)性顯著的，再利用線性回歸建立線性模型。采用Excel 2003作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　河水的重金屬評價

本研究對保護(hù)區(qū)內(nèi)東北林蛙越冬地的煙囪河上、中和下游河水重金屬含量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，三段河水中 6 種元素 As、Cd、Pb、Cr、Cu、Zn 的平均含量分別為 0.291±0.012、0.003±0.001、0.309±0.046、0.005±0.002、0.435±0.026、0.005±0.002 μg／L，并且各元素含量三段河水間差異不顯著。與國家環(huán)境保護(hù)總局發(fā)布的國家標(biāo)準(zhǔn)GB 3838－2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》五類地表水標(biāo)準(zhǔn)相比，河水中的6種重金屬含量均符合國家Ⅰ類標(biāo)準(zhǔn)，并且遠(yuǎn)低于Ⅰ類標(biāo)準(zhǔn)各元素的限量值。認(rèn)為東北林蛙棲息地水質(zhì)高于國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，該環(huán)境下所養(yǎng)殖的東北林蛙及其產(chǎn)品具有一定的安全性。

2.2　肌肉樣品的重金屬評價

捕獲并用于分析的東北林蛙體長為33.39～70.29 mm，平均為 55.478 mm；體重 3.157～39.045 g，平均為18.794 g。根據(jù)參考文獻(xiàn)［13］按體長進(jìn)行年齡鑒定，共分出3個年齡段：一齡、二齡和三齡。重金屬含量分析，發(fā)現(xiàn)Cr含量二齡顯著高于一齡和三齡（P＜0.01），說明Cr在東北林蛙肌肉組織中富集能力較強(qiáng)。同時林蛙二齡達(dá)到性成熟，重金屬的代謝能力增強(qiáng)，可能導(dǎo)致Cr含量二齡顯著高于一齡和三齡［14］。其他元素含量各年齡段間無顯著差異，說明As、Cd、Pb、Cu、Zn在肌肉組織中無富集現(xiàn)象（圖1和圖2）。

As、Cd、Pb、Cr、Cu、Zn 六種元素的平均含量為0.028±0.020 5、0.004±0.003 06、0.087±0.110 5、0.682±0.486 8、0.731±0.108 5 和 5.198±1.761 6 mg／kg。綜合參考國家食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 2762－2012《食品中污染物限量標(biāo)準(zhǔn)》、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 5073－2006《無公害食品：水產(chǎn)品中有毒有害物質(zhì)限量》和GB 13106－1991《食品中鋅限量標(biāo)準(zhǔn)》，對 As、Cd、Pb、Cr、Cu、Zn的限量規(guī)定分別為 0.5、0.1、0.2、1.0、50、50 mg／kg。本研究的東北林蛙肌肉中的6種重金屬均未超標(biāo)，均達(dá)到了國家食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

圖1　不同年齡段個體肌肉As、Cd、Pb的含量

圖2　不同年齡段個體肌肉Cr、Cu、Zn的含量

2.3　體長與肌肉重金屬含量的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析，表明東北林蛙肌肉Cu含量與體長顯著正相關(guān)（r＝0.624，P＜0.05）；Cd 與 Pb 含量存在極顯著的正相關(guān)（r＝0.874，P＜0.01），其他元素間或與體長間均無相關(guān)性。說明林蛙一至三齡間肌肉Cu含量隨著年齡增長有增加趨勢，Cd與Pb含量具有一定的同源性。并對上述的正相關(guān)進(jìn)行了線性回歸，以建立線性模型。肌肉Cu含量與體長的線性關(guān)系為 Cu＝0.005 L＋0.436（R2＝0.389，P＜0.05）；Cd 與Pb含量的線性關(guān)系為 Cd＝0.024 Pb＋0.003 （R2＝0.765，P＜0.01）。

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