星點設(shè)計－響應(yīng)面法優(yōu)化浸泡型桑葚果酒制作工藝

孫 敏 ，田 野 ，崔高超 ，魏騰飛 ，楊 芳

藥食同源的桑葚因其果肉多汁、色澤艷麗、香氣幽雅、色素含量高且穩(wěn)定，是釀酒的極佳原料［1］。桑葚中黃酮類化合物具有增強毛細血管強度、抗自由基、抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)血脂等生物學(xué)活性［2－8］。 桑葚水解物含槲皮素－3－O－蕓香苷、槲皮素己糖苷、槲皮素鼠李糖基己糖苷、山奈酚、鼠李糖苷、花青素－3－O－葡萄糖苷和花青素－3－O－蕓香苷具有抑制膳食丙烯酰胺誘導(dǎo)的活性氧過度產(chǎn)生，恢復(fù)細胞線粒體膜電位，抑制線粒體膜脂質(zhì)過氧化和谷胱甘肽的消耗，對抗膳食丙烯酰胺引發(fā)的細胞毒性，發(fā)揮保護細胞的作用［9］。目前，桑葚果酒的加工方法有浸提法和發(fā)酵法。浸提法以桑葚為原料，選擇合適的酒基進行浸泡。乙醇可以將桑葚中許多有益的成分萃取到酒中，這樣不僅將不易存放的桑葚保存，還能將桑葚的保健成分萃取出來。果酒中的總糖、總酸都是決定果酒口感的重要風(fēng)味物質(zhì)。有機酸具有抑菌、抗病毒、增加冠動脈流量、抑制腦組織脂質(zhì)過氧化等作用。

星點設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化法是一種新型的試驗設(shè)計方法。較均勻設(shè)計和正交實驗設(shè)計，星點設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化法更能夠靈敏地考察各因素間的交互作用，精確度更高，近些年逐漸被用于食品科學(xué)試驗的設(shè)計［10，11］。本研究通過星點設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化法來對浸泡型桑葚果酒制作條件進行設(shè)計，選擇料液比、酒基乙醇體積分數(shù)、桑葚粉碎時間為自變量，桑葚果酒總糖、總酸、總黃酮、感官綜合評分作為因變量，對自變量各因素水平進行多元線性回歸和多項式擬合，通過數(shù)學(xué)模型進行預(yù)測最佳浸泡型桑葚果酒制作工藝參數(shù)。

1　材料與方法

1.1　材料

桑葚：大十新鮮桑葚，產(chǎn)自陜西省安康市漢濱區(qū)張灘鎮(zhèn)。酒基為市售二鍋頭白酒（60%，V／V）。

1.2　儀器

SP－723型分光光度計 （上海光譜儀器有限公司）、UPT－II超純水機 （四川優(yōu)普超純科技有限公司）、ALC－210.4型微量分析天平 （德國賽多利斯公司）、Legend Micro17R微量冷凍高速離心機 （美國Thermo公司）、PHS－3C pH計 （上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3　藥品與試劑

30～60目聚酰胺、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化銨、無水葡萄糖標準品、石油醚、無水硫酸鈉、氯化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、乙醇、乙酸均為分析純，甲醇、槲皮素標準品均為色譜純。

1.4　方法

1.4.1浸泡型桑葚果酒總糖含量的測定 采用3，5－二硝基水楊酸法（DNS 法）測定［12］。 取一定量的待測桑葚果酒樣品，裝入離心管中，以3 000 r／min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取0.5 mL放入100 mL的三角瓶中，加入 7.5 mL的去離子水和 5 mL 6 mol／L的HC l，置于68℃水浴中加熱水解15 min。待其冷卻后，用6 mol／L的NaOH中和多余的酸。用去離子水將其定容到25 mL的容量瓶中混勻，即得待測液。

葡萄糖標準溶液配制（1.0 mg／mL）：在分析天平上準確稱取0.100 0 g分析純葡萄糖（預(yù)先在105℃干燥至恒重），溶于去離子水中。依次移取0、0.2、0.4、0.8、1.2 mL 標準葡萄糖工作液、2.0 mL 去離子水于6個5 mL比色管中，加去離子水補足至2 mL，再在每個容量瓶中加入1.5 mL顯色劑DNS，搖勻后將6個容量瓶放在沸水浴中加熱5 min，立即冷卻。用去離子水定容至25 mL，搖勻。以去離子水顯色反應(yīng)液做空白調(diào)零，用1 cm比色皿在540 nm處測其吸光度，繪制標準工作曲線。

總糖的測定：取20支25 mL的刻度試管編號，每管移取1 mL浸泡型桑椹果酒多糖的待測液、加去離子水補足至2 mL，再在每個容量瓶中加入1.5 mL顯色劑DNS。加熱、定容和比色等其余操作與制作標準曲線的方法相同。

總糖含量（g／L）＝查曲線所得水解后的還原糖（g／L）×稀釋倍數(shù)（100×25）×0.9

1.4.2浸泡型桑葚果酒總酸含量的測定 用鄰苯二甲酸氫鉀作基準物質(zhì)標定NaOH溶液。桑葚果酒12 000 r／min離心10 min后，移取上清液2 mL至離心管。用氫氧化鈉標準溶液進行滴定，利用pH計來調(diào)節(jié)終點電位與預(yù)控電位。滴定終點電位是8.3［13］。記錄此時消耗的氫氧化鈉的體積。按下列公式計算桑葚果酒總酸含量：總酸含量（g／L）＝C×Vk×V1／V2，其中，C 為氫氧化鈉標準溶液濃度（g／mL），Vk為檸檬酸系數(shù)［14］，V1為氫氧化鈉標準溶液消耗體積（mL），V2為桑葚果酒上清液取樣體積（L）。

1.4.3浸泡型桑葚果酒總黃酮的測定 采用聚酰胺吸附－硝酸鋁顯色法測定［15］。聚酰胺預(yù)處理：用90%乙醇浸泡，不斷攪拌，除去起泡后裝柱。用3倍體積的90%乙醇洗脫，洗至洗脫液透明并在蒸干后無殘渣。依次用2倍體積5%氫氧化鈉溶液、1倍體積的去離子水、2倍體積10%乙酸水溶液洗脫，最后用去離子水洗脫至pH中性，備用。

標準曲線的建立：準確稱取干燥的槲皮素標準品［16］10.60 mg 于 25 mL 容量瓶中，用 70%甲醇溶解，定容至刻度，得到濃度為424.0μg／mL的槲皮素標準溶液。 分別準確吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL槲皮素標準溶液于10 mL具塞試管中，用30%乙醇定容至5 mL，然后向每管中分別加入0.3 mL 5%NaNO2，搖勻后靜置 5 min，分別加入 0.3 mL 10%Al（NO3）3，搖勻后靜置 6 min，再分別加入 2 mL 1 mol／L NaOH，用30%乙醇定容至刻度，搖勻后靜置20 min，于510 nm處測定吸光度，以空白試劑為參比。

將顆粒狀聚酰胺混懸于水中，使其充分膨脹，然后裝柱20 mL。準確吸取1.0 mL桑椹果酒樣品，經(jīng)3 500 r／min離心10 min加入30～60目的聚酰胺層析柱中。用30 mL 70%甲醇洗脫，流速72滴／min，從甲醇溶液滴入水溶液中之后開始收集洗脫液，得到1.5 mL洗脫液。準確吸取4.0 mL洗脫液按標準曲線制作方法進行反應(yīng)，顯色測定。為扣除底色的影響，取 4.0 mL 洗脫液用 30%乙醇稀釋至 10.0 mL，作為參比。

1.5　響應(yīng)面設(shè)計

在前期預(yù)試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法（RSM）對影響浸泡型桑葚果酒制作的主要因素料液比（V／V，下同）、乙醇體積分數(shù)（%）和粉碎時間（min）3個因素為響應(yīng)因素進行優(yōu)化。每個因素設(shè)計5個水平，分別用代碼-α、-1、0、1、α（α＝1.682）表示，設(shè)計因素與水平見表1。以浸泡型桑葚果酒總糖、總酸、總黃酮、感官綜合評分為響應(yīng)值進行試驗安排。

表1　星點設(shè)計的因素與水平

1.6　浸泡型桑葚果酒感官綜合評價

浸泡型桑葚果酒制備完成，從果酒的色澤、香氣、滋味、風(fēng)格4個方面對桑葚果酒進行評分，評分標準見表2。

2　結(jié)果與分析

2.1　葡萄糖的測定線性關(guān)系考察

葡萄糖標準液的濃度為1 mg／mL，以標準液的濃度 0、0.008、0.016、0.024、0.032、0.04、0.048 mg／mL為橫坐標，以其對應(yīng)的吸光度（OD值）為縱坐標，繪制標準曲線，得直線回歸方程為 Y＝14.179X－0.000 7（R2＝0.994 4），表明在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2　浸泡型桑葚果酒感官評定標準

2.2　槲皮素的測定線性關(guān)系考察

槲皮素標準品濃度為424.0μg／mL，以標準品的濃度 0、8.48、16.96、25.44、33.92、42.40、50.88、59.36 mg／L為橫坐標，以其對應(yīng)的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線， 得直線回歸方程為 Y＝0.007 2X－0.002 3（R2＝0.999 7），表明在線性范圍內(nèi)（8.48～59.36 mg／L）線性關(guān)系良好。

2.3　星點設(shè)計試驗結(jié)果及響應(yīng)面分析

依據(jù)星點設(shè)計－響應(yīng)面法試驗方案進行3因素5水平試驗，星點設(shè)計試驗安排與桑葚果酒總糖、總酸、總黃酮、感官綜合評分4個響應(yīng)值結(jié)果見表3。

表3　星點設(shè)計試驗結(jié)果

2.4　模型擬合及工藝優(yōu)化

以浸泡型桑葚果酒總糖、總酸、總黃酮、感官綜合評分分別為因變量，使用Design－Expert軟件采用二次多項式非線性模型對各影響因素和指標進行回歸計算，其方程如下：

2.5　響應(yīng)曲面與等高線

采用Design expert 7軟件繪制二次多項式模型中X1、X2、X3中任意2因素對各評價指標的三維效應(yīng)曲面（其余自變量設(shè)為中心點值），見圖1至圖4。通過響應(yīng)面三維圖，可直觀地反映各因素的交互作用對響應(yīng)值的影響，有助于確定最佳浸泡工藝參數(shù)范圍。

圖1　粉碎時間和料液比對浸泡型桑葚果酒總糖影響的三維曲面和等高線

圖3　粉碎時間和乙醇體積分數(shù)對浸泡型桑葚果酒總黃酮影響的三維曲面和等高線

2.6　驗證試驗

經(jīng)Design expert 7軟件處理后得到的最佳條件為料液比為 59.70∶100，乙醇體積分數(shù)為 50.85%，粉碎時間為0.89 min。在此條件下進行驗證試驗，浸泡型桑葚果酒共3份，按照“1.4”各項方法進行試驗，結(jié)果見表4。根據(jù)優(yōu)化浸泡工藝參數(shù)，平行制備3份樣品，所得浸泡型桑葚果酒各指標實測值與理論預(yù)測值接近，表明建立的回歸方程預(yù)測性良好。

表4　優(yōu)化浸泡制作工藝驗證結(jié)果

圖2　乙醇體積分數(shù)和粉碎時間對浸泡型桑葚果酒總酸影響的三維曲面和等高線

圖4　乙醇體積分數(shù)和料液比對浸泡型桑葚果酒感官綜合評分影響的三維曲面和等高線

3　小結(jié)

選擇料液比、乙醇體積分數(shù)、粉碎時間為自變量，浸泡型桑葚果酒總糖、總酸、總黃酮、感官綜合評分作為因變量，對自變量各因素水平進行多元線性回歸和多項式擬合。通過星點設(shè)計－響應(yīng)面法優(yōu)化浸泡型桑椹果酒制作工藝，得到的最佳浸泡制作工藝參數(shù)為料液比 59.70∶100，乙醇體積分數(shù) 50.85%，粉碎時間0.89 min。浸泡型桑葚果酒預(yù)測值分別為總糖 28.00 g／L、總酸 1.82 g／L、總黃酮 101.76 mg／L、感官綜合評分90.00。在此條件下進行驗證試驗，浸泡桑葚果酒共3份，各項指標實測值分別為總糖27.27 g／L、總酸 1.87 g／L、總黃酮 99.92 mg／L、感官綜合評分88.00分。實測值與模型預(yù)測值間的偏離率分別為－2.6%、2.7%、－1.8%、－2.2%。根據(jù)優(yōu)化浸泡制作工藝參數(shù)，平行制備3份樣品，所得浸泡型桑葚果酒各指標實測值與理論預(yù)測值接近，表明建立的回歸方程預(yù)測性良好。

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