順氣化痰方對慢性阻塞性肺疾病大鼠炎癥因子及基質金屬蛋白酶的影響

郭　媛，耿立梅

(1. 石家莊大德中醫門診部，河北 石家莊 050000；2. 河北省中醫院，河北 石家莊 050011)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)以不完全可逆性及持續進展性氣流受限為特征。目前認為COPD的發病機制主要為炎性因子相關機制[1]，氣道黏膜發生炎性反應，釋放炎性遞質，氣道黏膜的結構發生改變，導致氣道的反復損傷和修復[2]。順氣化痰方為臨床治療COPD的有效方劑，本實驗旨在進一步探討該方的治療機制。

1　實驗資料

1.1實驗動物Wistar清潔雄性大鼠32只，體質量240～260 g，購自河北醫科大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(冀)2013-1-003。

1.2實驗試劑脂多糖(LPS，美國Sigma公司，批號：L2880-10，10 mg/瓶)；戊巴比妥鈉(上海陽光生物技術有限公司)；新石家莊牌香煙(石家莊卷煙廠，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.0 mg，煙氣一氧化碳量13 mg)；生理鹽水(石家莊四藥)；中性樹脂(上?；瘜W試劑公司)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)放射免疫分析藥盒(北京華埠力特生物技術研究所)；白細胞介素-8(IL-8)放射免疫分析藥盒(北京普爾偉業生物科技有限公司)。

1.3實驗儀器自制熏煙箱(80 cm×60 cm×50 cm有機玻璃箱)；導煙裝置(Longer-Pump)；大鼠解剖臺(張家港市青松生物醫學儀器有限公司)；IX-70倒置相差顯微鏡(日本Olympus)；FJ-2021型γ-放射免疫計數器(西安二六二廠)；756MC型紫外-可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；PE9600型PCR擴增儀(美國PE公司)；紫外透射儀(北京鼎國)，數碼顯微鏡 DP73(日本Olympus)；電冰箱(BCD 青島海爾)；石蠟包埋機(德國LEICA公司)。

1.4實驗藥物順氣化痰方，由蜜麻黃、杏仁、石膏、白前、前胡、浙貝母、紫菀、冬花、炙杷葉、甘草組成。大鼠用藥量按成人日服量換算，依據大鼠與人體表面積計算給藥量。

1.5動物分組及處理雄性Wistar大鼠于實驗室給予普通飼料喂養，自由飲水1周后，隨機將大鼠分為正常組、模型組、順氣化痰方高劑量組、順氣化痰方低劑量組，每組8只。除正常組外，其余組大鼠參照文獻[3]中煙熏聯合氣道滴入LPS法制備COPD模型。造模第1天和第14天，各造模組氣管內滴入濃度為1 g/L的LPS 200 μL，正常組氣管內滴入生理鹽水200 μL。第2—13天和第15—30天，將造模組大鼠放入自制熏煙箱內，經導煙裝置按每次15只香煙，每次20 min，間隔4 h，每日2次熏煙，每次熏煙濃度在5%左右。造模結束后，順氣化痰方高、低劑量組分別灌胃順氣化痰方13.5 g/kg、0.9 g/kg，正常組、模型組灌胃純凈水，均1次/d,連續30 d。

1.6觀察指標

1.6.1血清IL-8、TNF-α水平灌胃結束后第2天，10%水合氯醛麻醉大鼠，股動脈取血5 mL，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，分離血清，應用γ-放射免疫計數器測定各組大鼠血清IL-8、TNF-α水平。

1.6.2肺組織形態學處死各組大鼠后，切取右下肺組織，放于4%甲醛溶液內固定24 h，石蠟包埋，切片HE染色，數碼顯微鏡下拍照，觀察肺組織形態學變化。

1.6.3MMP-2、MMP-8mRNA表達情況

1.6.3.1總RNA的提取取少許溶解的RNA，用TE Buffer稀釋后于紫外分光光度計260 nm和280 nm處讀取A值，總RNA濃度= A260×稀釋倍數×0.04 μg/μL，用前調整為1 μg/μL。

1.6.3.2反轉錄反應取總RNA 2 μg，加入RT反應體系(含AMV Buffer，dNTPs，Oligo dT Primer，AMV，Rnase Inhibitor等)管中，于PCR儀42 ℃ 30 min(cDNA合成)，99 ℃ 5 min( 逆轉錄酶失活)，5 ℃ 5 min。 -20 ℃保存備用。PCR擴增條件:94 ℃變性3 min;94 ℃變性40 s，退火50 s，72 ℃ 90 s，30個循環;72 ℃延伸10 min。RT-PCR反應引物：MMP-2上游引物序列為5’-ACGATGATGACCGGAAGTGG-3’，下游為5’-GTGC TGGCAGAA TAGACCCA-3’；MMP-8上游引物序列為5’-TCCAGGTTACCCCACTAGCA-3’，下游為5’-TGCAACTCTAGTGACTCTGCG-3’;GAPDH上游引物序列為5’-GCAACTCCCATTCTTCCACC-3’，下游為5’-TGGTATTCGAGAGAAGGGAGGG-3’。

2　結　　果

2.14組血清IL-8、TNF-α水平比較模型組血清IL-8、TNF-α水平均明顯高于正常組(P均<0.05)；順氣化痰方高、低劑量組血清IL-8、TNF-α水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且高劑量組明顯低于低劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1　4組血清IL-8、TNF-α水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與順氣化痰方高劑量組比較，P<0.05。

2.24組肺組織病理學表現正常組大鼠肺組織無明顯炎性細胞浸潤，支氣管黏膜無增厚，支氣管上皮纖毛排列整齊無脫落，肺泡壁無變薄破裂，未見肺大泡形成(見圖1)。模型組大鼠肺組織可見慢性炎癥細胞浸潤，主要為巨噬細胞、淋巴細胞和單核細胞，可見支氣管壁增厚，纖毛脫落，氣道內可見黏液栓形成及慢性炎細胞肺浸潤，可見肺泡壁破裂形成肺大泡，血管壁亦可見增厚，主要為小葉中心型肺氣腫改變(見圖2)。順氣化痰方高、低劑量組較模型組炎細胞浸潤程度輕，肺氣腫小葉破壞較少，且高劑量組較低劑量組輕(見圖3及圖4)。

圖1　正常組肺組織病理改變(HE×200)

圖2　模型組肺組織病理改變(HE×200)

2.34組大鼠肺組織中MMP-2、 MMP-8mRNA表達情況模型組MMP-2、 MMP-8 mRNA表達量均明顯高于正常組(P均<0.05)；順氣化痰方高、低劑量組MMP-2、 MMP-8 mRNA表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且高劑量組明顯低于低劑量組(P均<0.05)。見表2。

圖3　順氣化痰方高劑量組肺組織病理改變(HE×200)

圖4　順氣化痰方低劑量組肺組織病理改變(HE×200)

表2　4組大鼠肺組織中MMP-2、 MMP-8mRNA表達情況

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與順氣化痰方高劑量組比較，P<0.05。

3　討　　論

關于COPD的發病機制學說，目前主要有慢性氣道和肺部炎癥形成、蛋白酶/抗蛋白酶失衡以及氧化劑/抗氧化劑失衡等。吸煙是引起氣道慢性炎癥和氣道重塑發生發展的主要因素[4]，多種炎癥細胞及細胞因子參與COPD炎癥的形成[5]，導致氣道壁受損和肺氣腫發生，其中IL-8和TNF-α最具代表性[6]。IL-8是中性粒細胞和T淋巴細胞強效趨化因子及化學激活劑[7]，在COPD氣道炎癥中起著直接的介導作用，可引起中性粒細胞向呼吸道遷移、活化，其水平升高可能是COPD病情遷延不愈的重要原因[8]。TNF-α可誘導氣道上皮細胞和中性粒細胞表達并分泌IL-8，同時促進激活的中性粒細胞分泌IL-8、TNF-α，在COPD氣道炎癥的持續和放大中起到重要作用[9]。MMP在肺氣腫、肺泡壁細胞外質破壞中起著重要作用。MMP是由中性粒細胞、肺泡巨噬細胞和氣道上皮細胞所產生，MMP增多使氣道結構組織失去支撐作用，而且還促進炎性細胞趨化、遷移、聚集及釋放炎癥因子和生長因子等，參與氣道壁的炎癥反應[10]。MMP-2、MMP-8分別屬于明膠酶和膠原酶，MMP-2具有降解肺組織彈力纖維的作用，參與氣道重塑，在肺氣腫的發生發展中起著重要作用[11-12]。研究顯示，肺組織中MMP-2表達越高，COPD患者肺功能下降越嚴重，氣道阻塞越明顯[13]。MMP-8在COPD患者的痰液、支氣管肺泡灌洗液和肺組織中表達[14]，與支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細胞數目成正相關[15]。

中醫認為COPD患者多有痰濁阻肺，邪留肺絡，宿根積久，肺氣升降失常，而氣逆多為痰，故治宜降氣順肺，氣降則痰自清。順氣化痰方中麻黃宣散外邪，石膏辛寒清熱，前胡、白前降氣化痰、止咳平喘，杏仁祛痰止咳、平喘，浙貝母清熱化痰、降氣止咳，紫菀潤肺下氣、消痰止咳，冬花潤肺養陰、化痰止咳，炙杷葉清肺和胃,降氣化痰，甘草清熱解毒、祛痰止咳。諸藥合用，具有降氣化痰、止咳平喘作用。本實驗結果顯示，順氣化痰方高、低劑量組血清IL-8、TNF-α水平和肺組織中MMP-2 mRNA、MMP-8 mRNA表達水平均明顯低于模型組，且順氣化痰方高劑量組各指標水平均明顯低于順氣化痰方低劑量組；HE染色顯示順氣化痰方高、低劑量組肺氣腫情況明顯輕于模型組。提示順氣化痰方可減輕COPD大鼠肺組織病理改變,可能與減輕氣道炎癥有關。

[參考文獻]

[1]Katdare M,Osborne MP，Telang NT． Inhibitionof aberrant proliferation and induction of apoptosis inpre-neoplastic human mammary epithelial cells by natural phytochemicals[J]. Oncol Rep,1998,5(2):311

[2]Hogg JC． Pathophysilolgy of airflow limitation in chronic obstructive pulmonary disease[J]. Lancet,2004,9435(364):709-721

[3]宋一平,崔德健,茅培英. 慢性阻塞性肺疾病大鼠模型氣道重塑及生長因子的研究[J]. 中華結核和呼吸雜志,2001,24(5):283-287

[4]Churg A,Tai H,Couthard T,et al. Cigarette smoke drives small airway remodeling by induction of growth factors in the airway wall[J]. Am J Respir Crit Care Med,2006,174(12):1327-1334

[5]Vosdoganes P,Hodges RJ,Lim R,et al. Human amnion epithelial cells as a treatment for inflammation-induced fetal lung injury in sheep[J]. Am J Obstet Gynecol，2011,205(2):156

[6]Chung KF. Cytokine in chronic obstructive pulmonary disease[J]. Eur Respir J,2001,34:50s-59s

[7]SmithWB,Gamble JR,Clark-Lewis I,et al. Interleukin-8 induces neutrophil transendothelial migration[J]. Immunology,1991,72(1):65-72

[8]DeBoer WI. Cytokines and therapy in COPD:a promising combination?[J]. Chest，2002，121(3):209S-218S

[9]姚海燕,吳大瑋. 慢性阻塞性肺疾病患者誘導痰IL-8、TNF-α水平和炎癥細胞的分布[J]. 中國老年學雜志，2007，27(14):1366-1369

[10] 安立,張洪玉,龐寶森,等. 基質金屬蛋白酶在阻塞性肺氣腫大鼠模型中的表達及部分細胞因子的水平[J]. 中華內科雜志,2003,42(3):181-185

[11] 王小莉,石鶯,龔興牡. MMP-2在實驗性大鼠慢性阻塞性肺疾病的表達及意義[J]. 臨床肺科雜志,2010,15(5):608

[12] Baraldo S,Bazzan E,Zanin ME,et al. Matrix metalloproteinase-2 protein in lung periphery is related to COPD progression[J]. Chest,2007,132(6):1733-1740

[13] Segura-Valdez L,Pardo A,Gaxiola M,et al. Upregulation of gelatinases A and B,collagenases 1 and 2,and increased parenchymal cell death in COPD[J]. Chest,2000,117(3):684-694

[14] Zheng L,Lam WK,Tipoe GL,et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-8 and-9 in bronchiectatic airways in vivo[J]. Eur Respir J,2002,20(1):170-176

[15] Yoshikawa T,Dent G,Ward J ,et al. Impaired neutrophil chemotaxis in chronic obstructive pulmonary disease[J]. Am J Respir Crit Care Med,2007,175(5):473-479