豬藍(lán)耳病抗體監(jiān)測(cè)及其規(guī)律的應(yīng)用

張成東　曲玖燕　彭先啟　郭海巖　崔松濤

（河南牧翔動(dòng)物藥業(yè)有限公司，河南鄭州 450000）

日常監(jiān)測(cè)是預(yù)防和控制流行性疫病的重要基礎(chǔ)[1]，是養(yǎng)殖戶評(píng)估免疫程序合理性、選擇疫苗種類(lèi)、掌握豬群健康狀態(tài)的重要手段。檢測(cè)數(shù)據(jù)可從側(cè)面反映豬場(chǎng)的管理水平高低。藍(lán)耳病（PRRS）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要包括抗原檢測(cè)和抗體檢測(cè)。抗原檢測(cè)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）；抗體檢測(cè)包括免疫熒光試驗(yàn)（IFA）、免疫過(guò)氧化物酶單層分析法（IPMA）、中和試驗(yàn)（SVN）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。

由于藍(lán)耳病病毒（PRRSV）核衣殼蛋白（N蛋白）不能誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒中和抗體，以N蛋白作為主要包被抗原的PRRSV抗體間接ELISA方法檢測(cè)結(jié)果，并不能反映機(jī)體的免疫狀態(tài)，故其不適合用于對(duì)疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)[2]。盡管N蛋白抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果不能真實(shí)反映豬的保護(hù)力，但是根據(jù)PRRS ELISA抗體S/P值的離散度結(jié)合多次抗體檢測(cè)，足以準(zhǔn)確判斷豬群藍(lán)耳病的感染狀態(tài)及變化趨勢(shì)[3]。與其他檢測(cè)方法相比，ELISA檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化、快速敏感等優(yōu)點(diǎn)，非常適合大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查和疫病監(jiān)測(cè)。

ELISA抗體檢測(cè)試劑盒作為市場(chǎng)上最早應(yīng)用的商品化檢測(cè)工具，是監(jiān)測(cè)PRRS的重要手段。目前，使用ELISA抗體檢測(cè)法追蹤并系統(tǒng)研究發(fā)病豬群在前驅(qū)期、明顯期及轉(zhuǎn)歸期等不同疾病發(fā)展階段PRRS抗體S/P值變化規(guī)律的文獻(xiàn)較少。為更全面揭示實(shí)際生產(chǎn)中PRRS的抗體變化規(guī)律，本研究跟蹤監(jiān)測(cè)了某規(guī)模化豬場(chǎng)藍(lán)耳病發(fā)病前驅(qū)期、明顯期及轉(zhuǎn)歸期的抗體S/P值。結(jié)合以上數(shù)據(jù)，筆者針對(duì)PRRSS/P值的變化規(guī)律與豬場(chǎng)生產(chǎn)成績(jī)的關(guān)系進(jìn)行了探討研究，期望能夠?yàn)槲覈?guó)PRRS的監(jiān)測(cè)和防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　血樣采集及處理

試驗(yàn)地點(diǎn)：新鄉(xiāng)德豐養(yǎng)殖場(chǎng)，存欄600頭母豬。采血時(shí)間：分別于豬群發(fā)病的前驅(qū)期（2016年10月）、明顯期（2016年11月）和轉(zhuǎn)歸期（2017年3月）隨機(jī)選擇母豬并逐頭采集前腔靜脈血5m L，待全血凝固析出血清后，4000 r/m in離心10 m in，取血清置于1.5 m L EP管，4℃環(huán)境存放備用。

1.2　ELISA抗體檢測(cè)

RT-PCR法檢測(cè)PRRS發(fā)病初期母豬血清抗原，NSP2基因引物[4]F：5’-TGGGCGACAATGTCCCTAAC-3’，R：5’-GCTGAGTATTTTGGGCGTGTG-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PRRS抗體檢測(cè)使用進(jìn)口IDEXX試劑盒。PRRS抗體的有無(wú)（陽(yáng)性/陰性）根據(jù)樣品的S/P值判定。如果S/P值＜0.4，樣品應(yīng)判定為PRRS抗體陰性；如果S/P值≥0.4，樣品應(yīng)判定為PRRS抗體陽(yáng)性。

2　結(jié)果與分析

2.1　豬場(chǎng)首次血清PRRS抗原檢測(cè)結(jié)果

用RT-PCR的方法擴(kuò)增NSP2基因，目的基因片段涵蓋變異株的基因缺失片段，用于區(qū)分經(jīng)典株和變異株[5]。經(jīng)典株擴(kuò)增基因片段508 bp，變異株擴(kuò)增基因片段418 bp。RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳顯示，24份血樣中（共25份血樣，其中1份數(shù)據(jù)丟失）共檢測(cè)出7份抗原陽(yáng)性，陽(yáng)性率29.2%，說(shuō)明母豬群存在PRRSV野毒感染，且豬群中存在經(jīng)典株和變異株（見(jiàn)圖1），存在病毒血癥的豬群中，變異毒株所占比重較大（占87.5%）。該豬群免疫過(guò)經(jīng)典株疫苗，未免疫過(guò)高致病株疫苗，表明本次發(fā)病由PRRSV變異株引起，可能與豬場(chǎng)8月份引進(jìn)的150頭后備母豬有關(guān)。

2.2　豬場(chǎng)連續(xù)3次血清PRRS抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果

首次抗體檢測(cè)結(jié)果：母豬采樣25頭，S/P值介于0.29～3.22；第二次抗體檢測(cè)結(jié)果：母豬采樣16頭，S/P值介于0.18～4.01；第三次抗體檢測(cè)結(jié)果：母豬采樣28頭，S/P值介于0.45～2.39。從母豬群抗體檢測(cè)結(jié)果可以明顯看出，豬群發(fā)病前驅(qū)期、明顯期和轉(zhuǎn)歸期PRRS抗體S/P值先升高再下降；其中豬場(chǎng)PRRS穩(wěn)定以后，抗體S/P值低于2.5（見(jiàn)圖2）。

2.3　豬場(chǎng)連續(xù)3次血清PRRS抗體S/P值分布

圖1　RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

IDEXX PRRS抗體檢測(cè)S/P＜0.4，PRRS為陰性；S/P≥0.4，PRRS為陽(yáng)性；當(dāng)豬群S/P≥2.5的比例大于5%，離散度大于40%時(shí)，豬群藍(lán)耳病風(fēng)險(xiǎn)較高。抗體檢測(cè)結(jié)果數(shù)值分布顯示（見(jiàn)表1），發(fā)病初期S/P值平均值為1.40，離散度為63.08%，S/P值≥2.5的比例為16%；發(fā)病高峰期S/P值平均值為1.91，離散度為63%，S/P值≥2.5的比例為31.25%；康復(fù)期S/P值平均值為0.84，離散度為45.82%，S/P值≥2.5的比例為0。由3次抗體檢測(cè)S/P值的分布可知，發(fā)病初期和高峰期PRRS S/P平均值會(huì)逐漸增大，且離散度較高；當(dāng)96.1%的母豬群PRRS抗體S/P值介于0.4～2.0時(shí)，豬群恢復(fù)正常。

圖2　母豬連續(xù)3次PRRS抗體檢測(cè)結(jié)果

2.4　豬場(chǎng)生產(chǎn)情況

從2015年10月份到2016年2月份，豬場(chǎng)育肥豬群相對(duì)穩(wěn)定（月死淘率在0.7%以內(nèi)），母豬群和保育豬群一直很不穩(wěn)定。如表2所示，母豬分娩率從2015年10月份到2016年1月份一直低于豬場(chǎng)的正常生產(chǎn)水平，2月份以后分娩率指標(biāo)恢復(fù)正常；保育豬從2015年10月份到2016年1月份死淘率居高不下，一直遭受副豬嗜血桿菌和腦炎性鏈球菌的困擾，嚴(yán)重時(shí)仔豬在哺乳期間就出現(xiàn)整窩發(fā)熱、喘氣的現(xiàn)象，直至3月份以后生產(chǎn)恢復(fù)正常。

3　討論

3.1　PRRSV ELISA抗體消長(zhǎng)規(guī)律

由于豬場(chǎng)之間是否免疫PRRS疫苗及接種疫苗毒株情況不一，且PRRSV ELISA檢測(cè)的抗體是非保護(hù)性中和抗體，故在通過(guò)抗體檢測(cè)數(shù)據(jù)判斷豬場(chǎng)PRRS感染狀態(tài)時(shí)，不能僅僅依靠單次檢測(cè)結(jié)果[6]（并非S/P值越高越穩(wěn)定），而要結(jié)合抗體檢測(cè)結(jié)果、豬場(chǎng)的疫苗免疫情況和各階段豬群的生產(chǎn)情況。判斷一個(gè)豬場(chǎng)PRRS的變化趨勢(shì)，需要定期監(jiān)測(cè)抗體，并綜合分析。

通過(guò)發(fā)病前驅(qū)期、明顯期、轉(zhuǎn)歸期3次抗體S/P值的變化可知，在豬場(chǎng)PRRS由穩(wěn)定到不穩(wěn)定的過(guò)程中，抗體S/P平均值會(huì)逐漸增大，且抗體離散度較大[7]；而在豬場(chǎng)PRRS由不穩(wěn)定到穩(wěn)定的過(guò)程中，抗體S/P平均值會(huì)逐漸變小，且抗體離散度較小。結(jié)合豬場(chǎng)的實(shí)際生產(chǎn)情況，當(dāng)絕大多數(shù)（96.2%）豬群S/P值介于0.4～2.0時(shí)，且離散度低于45%時(shí)，母豬分娩率達(dá)到85%以上，保育豬成活率達(dá)到96%以上，豬群藍(lán)耳病處于陽(yáng)性穩(wěn)定狀態(tài)。

表1　母豬連續(xù)3次抗體水平檢測(cè)結(jié)果分析

表2　豬場(chǎng)2015年10月至2016年3月母豬分娩率和保育豬成活率

3.2　PRRS抗體監(jiān)測(cè)及其規(guī)律的應(yīng)用

在中國(guó)普遍“藍(lán)”的大環(huán)境下[8-10]，中小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)該努力做到PRRS陽(yáng)性穩(wěn)定狀態(tài)。定期檢測(cè)各階段豬群的PRRS抗體，有助于掌握PRRS在各階段豬群的循環(huán)情況，監(jiān)控整個(gè)豬場(chǎng)PRRS的變化趨勢(shì)，便于及時(shí)做出決策（淘汰、藥物控制或者疫苗免疫）。及時(shí)淘汰S/P值高于2.5且生產(chǎn)成績(jī)很差的母豬及8胎以上的母豬，保持合理的種豬胎次結(jié)構(gòu)；在引進(jìn)后備種豬時(shí)，了解后備豬群的PRRS感染狀態(tài)，做好疫苗馴化或者淘汰母豬馴化[11]，有助于種豬群維持PRRS陽(yáng)性穩(wěn)定狀態(tài)。對(duì)于保育和育肥豬群PRRS階段性發(fā)病問(wèn)題，可以在豬群發(fā)病前1個(gè)月做經(jīng)典株弱毒苗的免疫，有利于維持豬群PRRS陽(yáng)性穩(wěn)定，減少損失；對(duì)于PRRS陽(yáng)性豬群，減少應(yīng)激，定期投喂大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素[12-14]，有助于維持豬群良好的生產(chǎn)狀態(tài)。

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