風味蛋白酶水解大豆分離蛋白的抗原性及功能特性變化

王章存　王　佩　安廣杰　胡金強　趙學偉　袁路陽

(鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，鄭州　450002)

大豆蛋白具有良好的乳化性、發泡性、持水性等加工性能[1-2]，在食品工業中廣泛應用。但是大豆也是公認的八大過敏原食品之一[3]，目前在大豆中發現38種蛋白具有致敏性(也稱為抗原蛋白)，其中主要抗原性蛋白成分是大豆11S球蛋白和和7S β-伴球蛋白，它們也是大豆中的主要蛋白質成分，其含量約占大豆總蛋白的80%；大豆抗原蛋白能夠引起人和動物的不良反應，嚴重的甚至會危及生命，有些患者的過敏癥狀會持續一生[4-5]。因此，降低大豆蛋白的抗原性對食品安全具有十分重要的意義。

目前降低大豆蛋白抗原性的方法有熱處理、酶解、超高壓處理、化學處理和培育低抗原性大豆品種等[6]。酶解可改變大豆抗原蛋白空間結構，并且使部分化學鍵斷裂，被認為是降低或消除大豆蛋白抗原性的有效方法[7]，近年來國內外均給予較高的重視[8]。酶解過程也會導致大豆蛋白加工性能的變化[9-10]。文獻中對酶解降低大豆蛋白抗原性的研究往往僅通過其酶解后蛋白質分子質量的變化來評價酶解效果，其可靠性遠不如用抗原-抗體反應方法。而對酶解后抗原性變化和乳化、發泡等加工性能變化的綜合性研究更少[11]。如何降低大豆蛋白的抗原性又改善或保持其功能特性值得深入研究。

本研究以大豆分離蛋白為原料，研究風味蛋白酶水解對其抗原性和功能特性的影響。通過對酶解過程中大豆分離蛋白分子成分、抗原性、乳化性和起泡性的分析，探討大豆蛋白分子變化與抗原性之間的內在聯系、抗原性變化和乳化等功能性變化規律等，為制備低抗原性和較好功能性質的大豆蛋白制品提供參考。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

大豆分離蛋白(SPI)：鄭州同創益生公司；11S大豆球蛋白和β-伴球蛋白酶聯免疫分析(競爭法ELISA)試劑盒：上海紀寧公司；風味蛋白酶：丹麥諾維信公司；其他試劑均為分析純。

1.2　儀器設備

DF-101S集熱式磁力攪拌器：河南予華公司；冷凍干燥機FD-1A-50：北京博醫康公司；DYY-7C 型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽：北京六一儀器廠；UV-8100 B紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器公司；iMark酶標儀：美國Bio-Rad伯樂公司。

1.3　試驗方法

1.3.1大豆分離蛋白的酶解

取大豆分離蛋白加水配置成10%溶液，加熱至60 ℃，用HCl調至pH6.5，按照酶/底物為0.5%加入蛋白酶，反應開始并計時。整個反應過程中滴加堿維持體系pH穩定，并記錄所消耗的堿的體積。反應到達一定時間后，沸水中煮沸10 min滅酶，之后冷凍干燥備用。

1.3.2蛋白質水解度的測定

本試驗采用pH-Stat法[12]。水解度的計算公式為：

式中：B為消耗堿量/mL；N為NaOH溶液濃度/mol/L；α為大豆蛋白氨基的平均解離度；m為蛋白質的總質量/g；htot為蛋白質中的肽鍵總數(在大豆蛋白質中為7.8 mmol/g)。

1.3.3酶解蛋白質分子成分變化

采用SDS-PAGE法[13]。電泳條件：5%濃縮膠，電壓為80 V；12%分離膠，電壓為110 V。電泳結束后，用考馬斯亮藍R-250染色。

采用Gel-PRO ANALYZER軟件定量分析電泳譜帶。

1.3.4酶解產物抗原性測定

采用競爭法酶聯免疫分析(ELISA)測定酶解產物的抗原性。操作步驟按試劑盒說明書進行。以抗原性剩余率表示酶解去除抗原效果。

1.3.5大豆分離蛋白溶解性的測定

采用雙縮脲法測定蛋白含量，以酶解液中可溶性蛋白含量與總蛋白含量比值表示。

1.3.6乳化性和發泡性測定

發泡性及發泡穩定性測定方法參考文獻[14]；乳化能力及乳化穩定性測定方法參考文獻[15]。

1.3.7 數據處理

采用Origin 8.0軟件分析。

2　結果與分析

2.1　風味蛋白酶酶解對大豆分離蛋白水解度(DH)的影響

水解度(DH)分析結果(圖1)表明，在酶解30 min內，大豆分離蛋白的水解度變化較快，反應10 min時DH即可達到5.1%，在酶解60 min后DH變化趨于穩定。

圖1　不同酶解時間條件下SPI水解度變化

2.2　酶解過程中大豆分離蛋白分子變化

大豆分離蛋白中的致敏蛋白主要是β-伴球蛋白和豆球蛋白，β-伴球蛋白由α、α′、和β 3個亞基組成，豆球蛋白由酸性多肽(A)和堿性多肽(B)組成[16]。為了考查酶解過程中蛋白質分子的變化，用SDS-PAGE法對酶解物進行了分離(圖2)，并用Gel-PRO ANALYZER軟件對電泳圖譜中的譜帶密度進行了定量分析(表1)。結果顯示，酶解10 min時，β-伴球蛋白的3個亞基以及豆球蛋白的兩個亞基顏色快速變淺，其中，α′、α和β3個亞基譜帶的光密度值分別降低了93%、87%、73%，A和B多肽的光密度值分別降低了83%和51%；與此同時，產生了3個分子質量分別為31、27、22 ku新譜帶(圖2中a，b，c所示)。酶解30 min時，β-伴球蛋白的3個亞基幾乎全部消失，豆球蛋白的酸性多肽和堿性多肽進一步降解。繼續延長酶解時間，豆球蛋白的酸性多肽逐漸減少，而堿性多肽和新產生的3個譜帶沒有明顯變化。這些譜帶具有明顯的抵抗風味蛋白酶水解的特征。用堿性蛋白酶水解豆粕的過程中也有類似現象出現[17]，這些成分抗酶解的原因及其存在的意義值得深入研究和探討。

注：泳道1～7分別是Marker、酶解0、10、30、60、90、120 min酶解產物。圖2　大豆分離蛋白酶解物SDS-PAGE圖譜

表1　大豆分離蛋白酶解物中主要亞基譜帶的OD值

MW/ku酶解時間/min01030609012082(α')685————70(α)11214————656113————50(β)10327————4010528————38(A)29950453025143317710945———31(a)—1311271251209527(b)—14815916315212222(c)—9810411312212920(B)339168130128126125

2.3　酶解產物抗原性變化

大豆蛋白酶解后的抗原性變化是近年來國內外研究的熱點。為了進一步考查經風味蛋白酶水解后，大豆分離蛋白分子變化與其抗原性變化之間的關系，本研究分別采用競爭法11S球蛋白和7S β-伴球蛋白ELISA試劑盒測定了酶解物的抗原性(見圖3)。可以看出，酶解10 min時，大豆蛋白的致敏性明顯降低，11S球蛋白和7S β-伴球蛋白的抗原剩余率分別降至43% 和56%。酶解30 min時，兩種蛋白的抗原剩余率分別降至25%和34%。繼續延長酶解時間，抗原剩余率變化趨勢趨于平穩。這與大豆分離蛋白水解度變化趨勢和SDS-PAGE圖譜中亞基變化趨勢基本一致。

值得注意的是，當酶解120 min時間內，11S球蛋白和7S β-伴球蛋白分子亞基早已完全消失時，其抗原性并未完全消除，而且在酶解10 min時新產生的3個譜帶(圖2中a、b、c所示)也沒有隨著酶解時間的延長而消失，顯然，酶解物的抗原性與這些抗酶解肽鏈有一定關系。這些抗酶解的肽鏈中可能含有序列性抗原決定簇，只要特定的氨基酸序列存在就表現出一定的抗原性。這些結果可以解釋加熱、高壓處理等方法消除抗原效果遠不如酶解方法的重要原因。至于哪一條抗酶解肽段具有抗原活性及其決定簇的氨基酸序列如何，本課題將進行后續研究。

圖3　酶解過程中大豆分離蛋白抗原性變化

2.4　酶解對大豆分離蛋白溶解性的影響

不同酶解產物的溶解性分析結果(圖4)表明，酶解初始階段(30 min)大豆分離蛋白的溶解性快速增加，隨著酶解時間的延長，酶解后溶解度變化趨于平穩。酶解至120 min時溶解性達到86%。此結果與水解度和分子質量圖譜的變化相對應。大豆分離蛋白經過酶解后，極性基團與小肽數目增加，親水性增強，從而利于提高大豆分離蛋白溶解性。

圖4　不同酶解時間條件下蛋白溶解性變化

2.5　酶解物的乳化性能分析

乳化能力和乳化穩定性是反映蛋白質及其酶解物乳化性能的重要指標。試驗結果(圖5)可以看出，隨著酶解時間的延長，大豆分離蛋白及其酶解物的乳化能力和乳化穩定性均顯示為先提高、后降低的趨勢。酶解30 min后的乳化能力降低幅度較大，乳化穩定性降低幅度較小。這可能由于酶解前期，蛋白質分子的空間結構發生較大變化，增加了大豆分離蛋白的溶解性，改善了蛋白質與油脂分子的結合性能。但隨著酶解時間的延長，雖然蛋白質溶解性仍有所增加，而蛋白質分子變小，維持蛋白質分子狀態的內部結構力(如氫鍵、范德華力等)被破壞，油滴表面的保護層變薄，導致乳化性能的降低[18]，另一方面，由于溶液中小分子肽增多，乳化液微粒直徑變小，乳化穩定性的變化不大。

圖5　酶解不同時間大豆分離蛋白的乳化性能變化

2.6　酶解物的起泡性能分析

酶解不同時間后大豆分離蛋白的起泡性和泡沫穩定性分析結果如圖6所示。可以看出，在酶解過程中，大豆分離蛋白的起泡性先升高后降低，泡沫穩定性逐漸降低。可能是因為酶的水解作用使大豆蛋白質分子的空間構象發生變化，從而影響了蛋白質的表面疏水性和分子柔性等，進而影響蛋白質的發泡性能。蛋白質的發泡能力和泡沫穩定性取決于不同分子性質，前者取決于蛋白質的疏水性、吸附速度和柔性，而后者主要受蛋白質膜的流變形狀影響，其中分子所帶凈電荷的影響較大[19-20]。此外，蛋白質分子中羰基和氨基之間的相互作用也會影響其發泡性能。

圖6　酶解不同時間大豆分離蛋白的起泡性能變化

3　結論

對風味蛋白酶水解大豆分離蛋白的研究表明，在酶解初始的30 min內，大豆蛋白水解度快速提高，大豆β-伴球蛋白的3個亞基以及豆球蛋白的兩個亞基快速減少；隨著酶解時間的延長，蛋白質水解度和各個肽成分變化不明顯。此外，在酶解10 min時新產生3個醒目的分子質量為31、27、22 ku的譜帶，即使延長酶解時間至120 min時這些譜帶也未消失，表現出較強的抗酶解作用。用競爭法ELISA試劑盒的分析表明，起初30 min酶解時間內，大豆蛋白的抗原性顯著降低，延長反應時間抗原性的變化趨于緩和，與大豆蛋白分子成分的變化趨勢一致，推測酶解后抗原性的存在與新生成的3個譜帶有密切關聯。

對風味蛋白酶水解后大豆分離蛋白的功能性質分析顯示，酶解10 min時，大豆蛋白酶解物的乳化性和發泡性最高，延長酶解時間這些功能性質明顯下降。綜上所述，本文認為，若用風味蛋白酶水解10～30 min時，即可有效降低大豆抗原性，同時也可獲得較好的乳化、發泡等功能性質。這些結果對開發低過敏性大豆蛋白食品和改善其加工性能具有積極作用。

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