菌酶協同發酵改善玉米-豆粕型飼料營養價值的研究

張　煜　石常友　王　成　王鳳芹　路則慶　汪以真

(浙江大學飼料科學研究所；浙江省動物營養與飼料重點實驗室； 農業部(華東)動物營養與飼料重點實驗室，杭州　310000)

近年來，隨著飼用抗生素使用的逐步受限，如何保障畜禽健康成為我國畜牧業的一大挑戰。玉米和豆粕是目前仔豬生產上主要的飼料原料[1]，而豆粕中的抗原蛋白、胰蛋白酶抑制劑及植酸等抗營養因子會阻礙消化道吸收利用營養物質，不利于動物生長和健康[2]。研究表明，生物發酵能有效降解飼料中的抗營養因子，促進養分的消化吸收，改善動物健康，減少飼用抗生素(促生長)的使用。選取合適的微生物進行飼料的發酵能有效降解飼料中的抗營養因子，促進養分的消化吸收，分泌的代謝產物如小肽，有機酸等利于改善動物健康[3-5]。

目前乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌被廣泛引用于飼料發酵。其中，乳酸菌產生的有機酸、細菌素等代謝產物有利于改善飼料的營養品質[6]，酵母菌能降解豆粕中的水蘇糖、棉子糖[7]，而枯草芽孢桿菌對豆粕中抗原蛋白具有較強的降解效果[8]。多菌株混合發酵理論上可以發揮不同菌株的發酵特性，但是不同菌株間存在可能存在拮抗作用[8]，比如，當米曲霉和干酪乳桿菌直接混合發酵豆粕，干會降低米曲霉對豆粕中抗原蛋白的降解效果[9]。而采用菌酶協同發酵，可以提高發酵過程中微生物對飼料中大分子物質利用效率，如纖維素酶水解秸桿生成的單糖能為酵母菌合成菌體蛋白提供能量[10]，進而提高飼料品質。

本研究以玉米、豆粕作為主要的發酵原料，通過單菌固態發酵比較不同菌株對飼料成分及營養價值的影響。進一步采用混菌發酵和菌酶協同的方式優化飼料的發酵工藝，制備抗營養因子含量低同時乳酸含量高的生物發酵飼料。隨后通過仔豬飼喂實驗對比生物發酵復合飼料與并將發酵飼料飼喂仔豬，檢驗飼料對于仔豬生長性能的影響，為實際生產中的應用提供參考。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

實驗菌株：枯草芽孢桿菌BS12為本研究室自行分離的菌株，枯草芽孢桿菌CICC20076和枯草芽孢桿菌CICC20070：中國工業微生物菌株保藏管理中心(CICC)；糞腸球菌EF(原始編號NCIMB10415)：山東寶利來生物有限公司；干酪乳桿菌LC和植物乳桿菌LP為本實驗室自行分離的菌株；釀酒酵母：中國工業微生物菌株保藏管理中心(CICC)；

豆粕：浙江某生物發酵公司。復合酶制劑：廣東某酶制劑公司。

主要儀器：Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀：德國FOSS公司；L-8900全自動氨基酸分析儀：日本 Hitachi公司；SpectraMax M5酶標儀：美國Molecular Devices公司等。

1.2　實驗方法

1.2.1發酵菌株的篩選

取9 g豆粕、9 g 玉米粉、2 g麩皮于100 mL三角瓶中攪拌均勻后配成復合飼料，于105 ℃滅菌15 min，按接種量5%別加入枯草芽孢桿菌CICC20076、枯草芽孢桿菌CICC21076、枯草芽孢桿菌BS12、釀酒酵母CICC1520、糞腸球菌EF、干酪乳酸菌LC和植物乳桿菌LP的種子液，同時加入滅菌水至飼料總含水量為45%，發酵體系內菌濃度達到1.0×107CFU/g，攪拌均勻后于37 ℃恒溫培養，進行固態發酵。實驗根據菌的種類不同共設7個組，每組3個重復，其中枯草芽孢桿菌CICC20076組、枯草芽孢桿菌CICC21076組和枯草芽孢桿菌BS12組發酵24 h，釀酒酵母CICC1520組發酵48 h，糞腸球菌EF組、干酪乳酸菌LC組和植物乳桿菌LP組發酵48 h。發酵結束后，將發酵飼料于60 ℃烘干，粉碎過60目篩后，測定發酵飼料中粗蛋白、豆粕抗原蛋白、中性洗滌纖維、酸溶蛋白以及乳酸含量。

1.2.2混菌發酵菌株配比優化實驗

將篩選出了芽孢桿菌BS12與糞腸球菌EF以不同比例添加入復合飼料，添加比如表1所示，按1.2.1方法先進行24 h好氧發酵，再進行48 h厭氧發酵，選取最優的發酵比例。

1.2.3復合酶制劑對纖維降解效果

為彌補細菌對纖維降解的不足。本研究中采用復合酶(主成分為：纖維素酶、甘露糖酶、果膠酶)強化飼料纖維的降解。分別以質量比0.3%、0.5%、0.7%和1.0% 加入復合飼料中，隨后經過枯草芽孢桿菌BS12和糞腸球菌EF分步發酵后，測定發酵飼料中中性洗滌纖維含量。

1.2.4菌酶協同發酵對飼料氨基酸體外消化率的影響

兩步酶法測定發酵復合飼料的體外消化率參考 Sakamoto等的方法進行[11]。分別取3 g發酵復合飼料和未發酵復合飼料，裝入150 mL三角瓶中。加入30 mL 10 000 U/mL的胃蛋白酶溶液(3 000 U/mg, Sigma)，用0.05 mol/L KCl-HCl緩沖液調整至pH為 2.0，隨后在39 ℃，150 r/min條件下 振蕩消化4 h。隨后用1 mol/L NaOH調整溶液pH為7.0，加入150 mg胰蛋白酶(250 U/mg, Sigma)于39 ℃，150 r/min繼續消化4 h。最后加入5 mL 20%的磺基水楊酸溶液終止反應，沉淀30 min。消化后的溶液在3 000 r/min條件下離心15 min，棄上清。剩余的殘渣在105 ℃條件下烘干處理4 h，獲得殘渣樣本。參照國標《GB/T 6432—1994》檢測發酵前后飼料中的粗蛋白含量[12]，參照國標《GB/T 18246—2000》檢測殘渣中粗蛋白和氨基酸的含量[13]。體外消化率按照如下的公式計算：

體外養分消化率=

1.3　仔豬飼養實驗

1.3.1發酵飼料的制備

玉米、豆粕和麩皮按45%、45%和10%的比例混合均勻，取200 kg的玉米豆粕復合飼料，按5%比例分別接種芽孢桿菌BS12、糞腸球菌EF和5%的復合酶制劑，初始濕度控制在40%左右，室溫條件下(30 ℃)好氧發酵24 h后；隨后裝入厭氧發酵袋，室溫條件下厭氧發酵48 h后烘干粉碎待用。

1.3.2動物實驗

選取192頭體重在(9.35±0.65) kg的49日齡健康仔豬(Duroc×Large white×Yorkshire)，隨機分配至兩個處理組，每個處理6個重復，每個重復16頭。處理組1飼喂玉米豆粕基礎日糧(對照組)，日糧中添加100 mg/kg喹乙醇和50 mg/kg吉他霉素；處理組2以10%發酵飼料替代基礎日糧中的玉米和豆粕(發酵飼料組)，且日糧中不添加抗生素，實驗期為24 d。于實驗期1 d及24 d稱取仔豬初始體重及末重，每日記錄采食量、計算平均日增重。實驗日糧組成及營養水平見表2。

表2　日糧組成及營養水平

注：預混料向每千克飼糧提供：VA 10,000 IU，VD3 1500 IU，VE 50 IU，VK3, 4.4 mg， VB1 3.0 mg，VB2 6.0 mg，VB6 3.0 mg，VB12 0.04 mg，D-泛酸23 mg，煙酸36 mg， 葉酸0.8 mg，生物素0.15 mg，氯化膽堿186 mg；硫酸銅50 mg，硫酸亞鐵80 mg，碘化鉀0.30 mg， 硫酸錳20 mg，亞硒酸鈉0.2 mg，硫酸鋅95 mg。

1.4　指標測定及方法

飼料中抗原蛋白含量的測定采用龍科方舟試劑盒根據酶聯免疫(ELISA)法進行測定；粗蛋白的測定參照《GB/T 6432—1994》；粗脂肪的測定參照《GB/T 6433—1994》[14]；；中性洗滌纖維的測定參照《GB/T 20806—2006》[15]；飼料中鈣的測定參照《GB/T 6436—2002》[16]；總磷的測定參照《GB/T 6437—2002》[17]；酸溶蛋白的測定參照Mahmoudreza等[18]的研究；飼料中乳酸采用羥基聯苯比色法[19]測定；飼料pH采用pH計直接測定。

1.5　數據統計與分析

采用SPSS19.0對實驗結果進行分析處理，采用ANOVA進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，所有結果均以平均數±標準差表示。

2　結果

2.1　單菌發酵對飼料營養成分的影響

由表3可知，本實驗中枯草芽孢桿菌對復合飼料中的大豆球蛋白和β-伴球蛋白降解程度較強，其中枯草芽孢桿菌BS12的降解能力最高，對大豆球蛋白降解率為87.40%，β-伴球蛋白為76.60%。除此以外，枯草芽孢桿菌發酵后，飼料中酸溶蛋白含量高于其他類型的實驗菌株，其中BS12發酵飼料中酸溶蛋白含量最高，提高了4.8倍。而枯草芽孢桿菌對飼料中纖維的降解程度也高于其他菌株。其中枯草芽孢桿菌BS12對中性洗滌纖維的降解率達到30.20%。相較于枯草芽孢桿菌和酵母菌，三株乳酸菌(糞腸球菌EF、干酪乳桿菌LC和植物乳桿菌LP)的產乳酸能力較強，其中，糞腸球菌EF最強，發酵48 h后飼料中乳酸含量達到110.53 mmol/kg。

為了實現降低飼料抗營養因子，提高飼料乳酸含量的效果，本研究采用枯草芽孢桿菌BS12與糞腸球菌EF進行混菌發酵實驗。

2.2　混菌發酵

如表4所示，枯草芽孢桿菌BS12的比例提高有利于提高飼料中抗原蛋白的降解率和酸溶蛋白的含量。盡管糞腸球菌EF的含量減小，飼料中乳酸含量差異并不顯著。采用當飼料中總菌量達到1.0×107CFU/g，芽孢桿菌BS12和糞腸球菌比例8∶1時，進行先好氧發酵24 h，再厭氧發酵48 h，飼料中大豆球蛋白含量減少至8.31 mg/g，β-伴球蛋白含量降低至6.44 mg/g，酸溶蛋白相較發酵前提高6.16倍，乳酸含量達到116.57 mg/g。

表3　不同菌株對飼料成分的影響

注：同一列不同上標字母表示差異顯著(P<0.05)。

表4　混菌發酵對飼料成分的影響

注：同一列不同上標字母表示差異顯著(P<0.05)。

表5　菌酶協同發酵對飼料成分的影響

注：同一列不同上標字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3　菌酶協同發酵對飼料營養成分的影響

由表5可知，添加纖維素酶、甘露糖酶及果膠酶制備的后，發酵飼料中性洗滌纖維降解程度提高。添加量為0.30%、0.50%、0.70%和1.00%時，相較于未發酵飼料，中性洗滌纖維降解率分別為35.41%、39.36%、40.32%和40.61%。但是抗原蛋白降解程度及乳酸含量變化并不顯著。

2.4　菌酶協同發酵對飼料氨基酸消化率的影響

由圖1可見，經過發酵后，飼料中粗蛋白消化率也得到提高，6種必需氨基酸和5種非必須氨基酸體外消化率得到顯著提高。其中，蛋氨酸、苯丙氨酸分別提高15.15% 和17.60%，丙氨酸，半胱氨酸，色氨酸分別提高了10.11%、10.05%和9.89%，粗蛋白消化率整體提高6.94%。

注：黑色，未發酵飼料；灰色，發酵飼料。圖1　菌酶協同發酵對飼料氨基酸體外消化率的影響

2.5　仔豬飼喂效果

由表6可知，相較于添加抗生素的對照組，飼料中添加10%的發酵飼料有利于提高采食量和日增重。較于對照組，發酵飼料組仔豬料肉比和腹瀉率相差異并不顯著。

表6　菌酶協同發酵飼料對仔豬生產性能影響

注：同一列不同上標字母表示差異顯著(P<0.05)。

3　討論

通過生物發酵降低飼料中抗營養因子的含量，從而提高動物對飼料養分的消化利用率，已成為飼料工業發展的重要方向[20-23]。目前研究多為發酵單一原料，如發酵豆粕[3]、發酵菜粕[24]和發酵DDGS[25]。但是對于混合原料發酵的研究并不充分。本研究以玉米、豆粕和麩皮配制成混合原料，采用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、糞腸球菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌進行發酵實驗，通過比較不同菌株對飼料中抗原蛋白降解程度、纖維降解程度及發酵后飼料中乳酸含量的影響，發現枯草芽孢桿菌對飼料原料中蛋白和纖維的降解程度更高，乳酸菌產乳酸能力更強。Chi等[7]也發現相較于酵母菌和乳酸菌，解淀粉芽孢桿菌對豆粕蛋白的降解程度更高。這可能是由于芽孢桿菌能分泌大量蛋白酶和纖維素酶，對大分子蛋白和纖維降解能力較強[26]。乳酸菌雖然可以發酵產生乳酸，但是在固態發酵中對飼料中抗原蛋白的降解能力不強[27]。

為綜合芽孢桿菌對豆粕抗原蛋白的降解特性與乳酸菌的產乳酸特性，本研究選取了枯草芽孢桿菌中對蛋白和纖維降解性較能強的BS12和乳酸菌中產酸能力較強的糞腸球菌EF進行混菌發酵實驗。但是，枯草芽孢桿菌為好氧細菌，而糞腸球菌為兼性厭氧細菌[28]，完全進行好氧發酵或厭氧發酵會抑制其中一種菌的生長。Chen等[9]采用分步發酵的方法用米曲霉先降低豆粕中的抗原蛋白，再用干酪乳桿菌發酵提高乳酸含量，降低豆粕pH。曲露等采用先好氧再厭氧的分步發酵方式，先降低菜籽粕中的硫甙和植酸，并提高粗蛋白及小肽含量，再通過厭氧發酵增加有機酸提高風味[29]。本研究采用同步加菌，先好氧發酵24 h，再厭氧發酵48 h的工藝。分步發酵降低了飼料中的抗原蛋白，且抗原蛋白降解程度和BS12單菌發酵相似，而乳酸含量也與EF單菌發酵結果相當。這說明，分步發酵工藝同樣適用于玉米-豆粕型復合飼料的發酵。

飼料原料中含有大量的植物纖維[30]。其中中性洗滌纖維過高會增加食糜黏度，阻礙其在仔豬腸道內的正常推進，增強飽腹感，降低采食量[31-32]。非淀粉多糖酶有助于分解細胞壁，釋放營養成分，提高干物質、有機物及粗蛋白的消化利用率[33]。本研究采用通過添加復合酶對發酵飼料進一步優化[34]。結果顯示，發酵過程添加非淀粉多糖復合酶(纖維素酶、甘露糖酶和果膠酶)，進一步降低了飼料中的中性洗滌纖維含量[35]。發酵后，粗蛋白、蛋氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸，半胱氨酸和色氨酸的體外消化率提高明顯。其中，蛋氨酸、丙苯氨酸和色氨酸是豬日糧中的必需氨基酸，而半胱氨酸是半必需氨基酸[36]。倪良振等研究發現，在含5.8%酸性洗滌纖維的日糧中添加纖維素酶極顯著提高煙臺黑豬對蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸的回腸表觀消化率[37]。因此，采用非淀粉多糖酶和枯草芽孢桿菌、糞腸球菌協同發酵降解飼料中的大分子蛋白和纖維，產生小分子肽和游離氨基酸，更有利于仔豬對氨基酸的消化利用[38]。

仔豬飼喂實驗進一步證明，相較于添加了抗生素的對照組，采用10%的菌酶協同發酵復合飼料有利于提高仔豬生長性能，且料肉比和腹瀉率并未發生顯著變化。

4　結論

本研究通過發酵實驗篩選了1株高效降解豆粕抗原蛋白的枯草芽孢桿菌BS12和1株產乳酸能力較強的糞腸球菌EF，用于玉米豆粕型復合飼料的發酵。結果顯示，將BS12與EF按總菌量1.0×107CFU/g， 菌量比8∶1接種于復合飼料，同時接入5% 的復合酶，發酵72 h，可降解飼料中80%的大豆抗原蛋白，且乳酸含量達到122.18 mmol/kg。所得發酵復合飼料提高了仔豬采食量和日增重，有利于提高仔豬生長性能，減少飼用抗生素使用。

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