玉米赤霉烯酮對大鼠睪丸支持細胞凋亡蛋白釋放的影響及NAC的保護效應

薛畫眉， 郭宏元， 王光光， 鄒　輝， 袁　燕， 顧建紅， 劉學忠， 劉宗平，2， 卞建春，2

(1.揚州大學獸醫學院，江蘇揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇揚州 225009)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，簡稱ZEA)在全世界動物飼料和人類糧食中普遍存在，它主要是由鐮刀菌污染而產生的一種非甾體雌激素類霉菌毒素[1]。據報道，玉米及飼料中ZEA的超標能夠引起公豬性欲下降，血清中睪酮含量急劇降低，導致睪丸的病理性萎縮，精子發生障礙，甚至出現雌性化等病變[2]。睪丸支持細胞(sertoli cell，簡稱SC)在雄性動物精子發生過程中發揮著不可或缺的作用，精子的發生障礙與睪丸支持細胞受損密切相關。睪丸支持細胞是眾多環境污染物作用于雄性生殖系統的靶細胞[3]。靶向破壞睪丸支持細胞將導致生精細胞快速、大量非生理性死亡[4]。因此，研究ZEA對睪丸支持細胞的損害作用及其機制，對揭示ZEA雄性生殖毒性機制具有重要作用。本試驗以不同濃度的ZEA處理大鼠原代睪丸支持細胞24 h，觀察ZEA對睪丸支持細胞線粒體凋亡蛋白Cyt C、AIF釋放的影響和NAC對ZEA引起的睪丸支持細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達變化的影響，為揭示ZEA的雄性生殖毒性機制及ZEA中毒的防控提供理論依據。

1　材料與方法

1.1　試驗動物

18～21 d 清潔級Wistar大鼠(由揚州大學比較醫學中心提供)。

1.2　主要試劑

玉米赤霉烯酮，購自美國Sigma公司；胎牛血清(FBS)、DMEM/F-12培養基等試劑，購自美國Gibco公司；胰蛋白酶等試劑，購自美國Amresco公司；L-谷氨酰胺、青鏈霉素等試劑，購自美國Boston Biomedical公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡試劑盒，購自美國BD公司； Bax、Bcl-2、Cyt C、AIF、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9等單克隆抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG，均購自美國CST公司；硝酸纖維素膜，購自美國Pall Corporation公司； BCA蛋白濃度測定試劑盒，購自中國碧云天生物技術研究所；預染蛋白分子量標準和ECL化學發光底物檢測試劑盒，購自美國Thermo公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3　大鼠原代支持細胞的分離與培養

取18～21 d Wistar雄性大鼠，脫頸處死后，無菌操作取出雙側睪丸，置于預冷的無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中并轉移至超凈工作臺內操作。用預冷的PBS將睪丸沖洗3遍后，將睪丸置于直徑100 mm的玻璃平皿中，用眼科鑷撕去周圍脂肪組織及精索，再用眼科剪和眼科鑷小心剝去白膜及內部較大血管，并用眼科鑷輕輕將曲細精管拉散，置于0.25%胰蛋白酶溶液中，密封后在水浴搖床中于150 r/min 37℃消化15 min至組織碎塊呈線索狀，加入等體積含血清PBS溶液終止消化，800 r/min、4 ℃ 離心10 min。棄去上清液體，加入0.5%膠原酶溶液，密封后在水浴搖床中于150 r/min 37 ℃消化15 min，至酶液呈黏液狀，加入等量含10%FBS的DMEM/F-12培養基終止消化，用100目的網篩進行過濾，將濾液于800 r/min、4 ℃離心 10 min。離心后用DMEM/F-12培養基重懸，重復清洗3次即可，于5%CO2、37 ℃條件下進行培養。對支持細胞的純化采用低滲處理法[5]，細胞培養24 d后，吸去培養基，用PBS清洗1次后，加入pH值為7.4的20 mmol/L Tris-HCl 處理3 min，吸去處理液，用PBS清洗3次，加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12培養基繼續培養。

1.4　細胞染毒和線粒體及胞漿中AIF、Cytc C蛋白的制備

以不同濃度(0、5、10、20 μmol/L)ZEA處理睪丸支持細胞24 h后，用0.25%胰酶消化5 min，離心收集細胞不少于1.0×107個(1 200 r/min，5 min，4 ℃)，用4 ℃預冷PBS將細胞洗滌2次。加入300 μL Mito-Cyto Buffer重懸細胞，將細胞懸液移入玻璃勻漿器中，研磨80次(4 ℃冰上操作)。將勻漿液轉移至4 ℃預冷的1.5 mL EP離心管中，離心(12 000 r/min，10 min，4 ℃)，沉淀即為線粒體，上清為胞漿蛋白；將上清收集至1.5 mL EP離心管中。沉淀中加入 100 μL 線粒體裂解緩沖液，于冰上裂解30 min，離心(12 000 r/min，10 min，4 ℃)，收集上清，即得線粒體蛋白，用BCA法測胞漿蛋白及線粒體蛋白濃度，-80 ℃保存備用。

1.5　NAC對ZEA致睪丸支持細胞凋亡的影響

以每孔1.0×105個細胞的密度接種于六孔板中，添加NAC(0、20 μmol/L ZEA，100 μmol/L NAC，20 μmol/L ZEA+100 μmol/L NAC)處理24 h后，用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒檢測SC細胞凋亡情況。分別設空白組(未加染料)、PI單染組、FITC單染組和處理組(PI和FITC雙染)。預先將10×Binding Buffer 加DDW稀釋成1×Binding Buffer，備用；用0.25%胰酶消化3 min，收集細胞(1 500 r/min，5 min，4 ℃)預冷1×PBS洗滌細胞，離心后加入100 μL 1×Binding Buffer 重懸細胞，加入AnnexinV-FITC和PI各5 μL單獨或聯合作用，37 ℃避光反應15 min，200目尼龍網過濾，在1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

同樣方法添加NAC處理24 h后(分組同上)，收集染毒后的睪丸支持細胞，用預冷的PBS洗滌2次，用細胞裂解液冰浴裂解細胞30 min，超聲波細胞破碎儀裂解30 s，12 000 r/min 離心10 min取上清，用BCA法進行蛋白定量，-80 ℃ 保存備用，以測定調控凋亡蛋白Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-9和cleaved-Caspase-3等的表達量。

1.6　Western Blot法檢測凋亡相關蛋白的表達

用蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測以上保存樣品的凋亡相關蛋白Cyt C和AIF的釋放量及Caspase-3、Caspase-9的蛋白表達水平，同時檢測Bcl-2、Bax蛋白表達水平。

蛋白樣品上樣10 μL/孔，Bench Marker 5 μL，其余孔內加10 μL 1×Loading Buffer，濃縮膠140 V、20 min，分離膠 110 V、100 min，根據marker指示，確定停止時間。置于電轉液中，轉膜120 V，90 min。用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗2次，吸盡液體后，加入稀釋好的一抗(表1)，4 ℃孵育過夜；隔日回收一抗，用TBST洗滌5次，每次5 min，加入稀釋好的二抗，室溫孵育2 h，用TBST洗滌5 次。

表1　一抗稀釋比例及所用稀釋液

用ECL檢測液發光顯影定影。

1.7　數據處理與統計分析

2　結果與分析

2.1　ZEA對睪丸支持細胞線粒體AIF和Cyt C釋放的影響

用0、5、10、20 μmol/L ZEA處理睪丸支持細胞24 h后，與對照組相比，隨著ZEA濃度的增加，胞漿中AIF和Cyt C的釋放量增加，線粒體中AIF和Cyt C的表達量減少。分析灰度值見圖1。結果顯示，與對照組相比，線粒體中Cyt C表達量呈現出 5 μmol/L ZEA處理組顯著下降(P<0.05)和10、20 μmol/L ZEA處理組極顯著下降(P<0.01)；各染毒組線粒體中AIF表達量均極顯著下降(P<0.01)；胞漿中Cyt C呈現出 10 μmol/L ZEA處理組顯著上升(P<0.05)和20 μmol/L ZEA處理組極顯著上升(P<0.01)；10、20 μmol/L ZEA處理組胞漿中AIF表達量呈極顯著上升(P<0.01)，呈現“劑量-效應”關系。

2.2　NAC對ZEA致睪丸支持細胞凋亡的影響

用100 μmol/L NAC預處理睪丸支持細胞30 min后，用20 μmol/L ZEA作用睪丸支持細胞24 h，流式細胞術檢測細胞凋亡率。圖2結果顯示，與20 μmol/L ZEA處理組相比，NAC與ZEA共處理組R5象限凋亡細胞數量明顯減少。與ZEA單獨處理組相比，NAC與ZEA共處理組凋亡率極顯著降低(P<0.01)。

2.3　NAC對ZEA致睪丸支持細胞Bax和Bcl-2蛋白表達調控

用100 μmol/L NAC預處理睪丸支持細胞30 min后，用20 μmol/L ZEA作用睪丸支持細胞24 h，用Western Blot法檢測Bax、Bcl-2蛋白表達變化情況見圖3。結果顯示，與20 μmol/L ZEA單獨處理組相比，100 μmol/L NAC與 20 μmol/L ZEA聯合處理組Bcl-2/Bax值有極顯著升高(P<0.01)。

2.4　NAC對ZEA致睪丸支持細胞Caspase-3、Caspase-9蛋白活化的調控

用100 μmol/L NAC預處理睪丸支持細胞30 min后，用20 μmol/L ZEA作用睪丸支持細胞24 h，用Western Blot法檢測cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3蛋白表達變化情況。圖4結果顯示，與20 μmol/L ZEA單獨處理組相比，100 μmol/L NAC與20 μmol/L ZEA聯合處理組cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3表達量極顯著下降(P<0.01)。

3　討論

Cyt C是由亞鐵血紅素和多肽組成的一種可溶性色素蛋白，作為線粒體呼吸鏈中傳遞電子的載體，與富含不飽和脂肪酸的線粒體內膜外側的磷脂結合，呈點狀分布，在生理條件下限制其自由穿透線粒體外膜。凋亡發生時，線粒體中的細胞色素C將被釋放到細胞漿中，激活caspase級聯蛋白，加劇凋亡的進行，釋放的細胞色素C活化Caspase-9，進一步激活凋亡家族中的關鍵性蛋白Caspase-3。ZEA誘導人類肝細胞發生caspase依賴的線粒體介導的凋亡，其中活性氧(reactive oxygen species，簡稱ROS)的產生在線粒體畸變和Cyt C的釋放中起著關鍵作用[6-7]。本研究發現，ZEA處理睪丸支持細胞能夠導致線粒體中Cyt C釋放到胞漿中。AIF在凋亡發生過程中調控線粒體膜的通透性，位于線粒體外膜內。在線粒體遭到損傷刺激時，轉移至胞漿和細胞核中，參與凋亡進程。Yu等研究證實，ZEA通過調控RAW264.7中AIF的釋放而介導caspase非依賴凋亡的進程，在ZEA誘導山羊間質細胞發生凋亡中AIF起到了關鍵性作用，Cyt C一般涉及caspase依賴的細胞凋亡，而AIF和End G在caspase非依賴凋亡中發揮著重要作用[8-10]。本試驗中，AIF隨ZEA濃度的升高，在線粒體中的表達量降低，在相應的胞漿中的表達量遞增。說明caspase依賴和caspase非依賴性凋亡信號通路共同調節ZEA誘導睪丸支持細胞凋亡的發生。

NAC在致神經元死亡的體內和體外模型中均起到保護作用[11]。GHhosh等研究表明，在黑色素瘤細胞中，用ROS特異性清除劑NAC阻斷ROS的生成，可抑制ROS誘導的Bax表達量上升和Bcl-2表達量下降[12]。在敗血癥和急性肺損傷模型試驗中，口服NAC(150 mg/kg)的適當劑量能夠降低肺組織中Caspase-3的表達[13]。本試驗結果表明，抗氧化劑NAC能夠明顯抑制因ZEA暴露引起的睪丸支持細胞凋亡發生；Bcl-2/Bax值升高，cleaved-Caspase-9和cleaved-Caspase-3的蛋白表達量均降低，與相關研究存在一致性[14]。NAC顯著降低睪丸支持細胞因ZEA引起的氧化損傷，線粒體得到了有效保護。Bcl-2基因產物大量存在于活性氧產生的關鍵場所——線粒體內膜，Bcl-2的上調使線粒體膜免于脂質過氧化的損傷；Bcl-2的表達量回升，可以有效地抑制Bax、cleaved-Caspase-9和cleaved-Caspase-3等凋亡執行蛋白表達；Bax的下調，使線粒體膜的通透性維持穩態，從而阻斷ZEA激活線粒體凋亡通路，延緩ZEA引起的睪丸支持細胞凋亡發生。綜上所述，NAC可以對ZEA誘導的睪丸支持細胞的凋亡發生起抑制作用。

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