桃葉衛矛莖尖超低溫保存及再生

李　享， 蘇　晴， 宋　紅

(1.東北林業大學園林學院，黑龍江哈爾濱 150040； 2.東北農業大學，黑龍江哈爾濱 150030)

桃葉衛矛(EuonymusbungeanusMaxim)不僅是華北地區良好的園林綠化觀賞樹種，而且在工業、食品、醫療等方面也具有一定的應用價值。為了能對桃葉衛矛的應用潛力有進一步的開發利用，對其種質資源的保護勢在必行。

常規的離體保存須要經常繼代，耗費大量人力、物力，而且易污染和變異。而玻璃化法超低溫保存具有操作簡單、效果和重演性好等優點[1-2]，是目前較為理想的植物種質資源長期穩定的保存方法。另外莖尖具有良好的分生能力，因此目前已經廣泛地將其應用于植物種質資源的離體保存，同時玻璃化法是目前國內莖尖超低溫保存采用的主要方法，在胚狀體、懸浮細胞、原生質體的超低溫保存中也有所報道[3-5]。尹明華等采用包埋玻璃化法對江西山藥(DioscoreaoppositaThunb.)莖尖進行超低溫保存并對其遺傳穩定性進行檢測[6]。張艷秋等對菊花(Dendranthemamorifolium)莖尖玻璃化法超低溫保存技術進行了研究[7]。韓麗對菊芋(Helianthustuberosus)品種莖尖超低溫保存進行了研究，最終建立了菊芋莖尖超低溫保存體系[8]。本試驗以桃葉衛矛為研究材料，選用莖尖作為外植體進行超低溫保存，以期探索桃葉衛矛種質資源保存的新途徑。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

本試驗所采用的材料為桃葉衛矛的莖尖，采自東北林業大學園林學院苗圃內3年生桃葉衛矛樹。

1.2　試驗方法

1.2.1超低溫保存方法無菌條件下剝取長度分別為1～2、2～3、3～5 mm的無菌組培苗的莖尖，分別放入裝有不同濃度(0.1～0.5 mol/L)的蔗糖中進行預培養。預培養環境條件為25 ℃暗培養，培養時間為0、1、2、3 d。莖尖經過預培養處理后再用無菌牙簽將莖尖挑入裝有Loading溶液的冷凍管中，室溫下裝載0、10、20、30 min。然后轉入在玻璃化溶液PVS2中，在0 ℃冰盒中處理0、20、40、60 min后投入液氮中保存。有文獻顯示，保存1 d和保存10個月的櫻桃(Cerasuspseudocerasus)在保存效果上沒有明顯區別[9]。而莖尖在液氮中保存1 h以上后，其保存時間將不再影響保存效果，因此本試驗中選擇保存 1 h。

1.2.2化凍、再培養將裝有莖尖的冷凍管從液氮中撈出后迅速投入40 ℃水浴鍋中化凍70 s，然后轉入Uploading溶液中處理0、10、20、30 min，洗滌過程在無菌環境中進行。后接種在不同的恢復培養基上進行培養，培養條件為先在25 ℃人工氣候箱中暗培養7 d，然后轉入組培苗培養室進行培養。根據不同生長調節劑的配比將恢復培養基設置為：(1)MS；(2)MS+1.0 mg/L 6-BA；(3)MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。

1.3　試驗數據的處理與分析

正交試驗采用Minitab進行設計，并利用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 20.0對試驗數據進行統計、分析以及制圖。

2　結果與分析

2.1　桃葉衛矛莖尖長度對超低溫保存后莖尖成活率的影響

在桃葉衛矛莖尖剝離的過程中，通過體視顯微鏡可以觀察到桃葉衛矛莖尖部位是對稱型，因此在剝離過程中可以依據所剩幼葉的對數來確定莖尖長度。本次試驗中共設置1～2 mm(不包含葉原基)、2～3 mm(包含1對葉原基)、3～5 mm(包含2對葉原基)3個梯度。試驗結果表明，桃葉衛矛莖尖長度對超低溫保存后莖尖成活率有顯著影響。當莖尖長度為2～3 mm時，超低溫保存后莖尖成活率可達83.33%，遠大于長度為1～2、3～5 mm的莖尖(圖1)。當莖尖長度為1～2 mm 時，由于莖尖分生組織外面沒有幼葉包被，使得分生組織承受較大損害，最終失活；而當莖尖長度為3～5 mm時，雖然莖尖分生組織得到良好的保護，但是由于莖尖體積過大，導致在玻璃化過程中莖尖分生組織部位脫水不徹底，進而使得在超低溫保存過程中形成結晶破壞細胞結構，最終使得莖尖失活。

2.2　預培養液蔗糖濃度對超低溫保存后莖尖成活率的影響

將剝離的莖尖放入不同蔗糖濃度的預培養液中進行預培養后，莖尖經過超低溫保存后的成活率各有不同，試驗結果如圖2所示。當蔗糖濃度在0.1～0.2 mol/L范圍內時，超低溫保存后莖尖的成活率不足10%；而隨著蔗糖濃度的進一步升高，莖尖成活率逐漸增加；當蔗糖濃度增至0.4 mol/L時，莖尖成活率最高可達60%；當蔗糖濃度為0.5 mol/L時，莖尖成活率降至10%。由此可以看出，預培養液中蔗糖濃度過低或過高都會導致莖尖成活率不高。

2.3　預培養時間對超低溫保存后莖尖成活率的影響

將莖尖放入0.4 mol/L蔗糖預培養液中培養不同時間，超低溫保存后莖尖成活率如圖3所示。當莖尖未經預培養階段直接進行下一程序時，莖尖全部失活，由此可知，桃葉衛矛莖尖超低溫保存中預培養步驟是至關重要的；隨著預培養時間的增加，莖尖成活率呈現出先升高后降低的趨勢，預培養時間為2 d時，莖尖成活率升至最高，可達66.67%；而隨著預培養時間的進一步延長，莖尖成活率出現下降趨勢，當預培養時間為3 d時，莖尖成活率下降26.67百分點。由此可知，最佳的預培養時間為2 d。

2.4　裝載液處理時間對超低溫保存后莖尖成活率的影響

為了減少PVS2對莖尖的損害，所以采用2 mol/L丙三醇(甘油)+0.4 mol/L蔗糖組成的裝載液對莖尖進行處理，裝載液處理時間對超低溫保存后莖尖成活率的影響如圖4所示。結果表明，莖尖經過裝載液處理和對照組之間存在顯著差異，當莖尖不經裝載液處理直接進行PVS2脫水處理時，莖尖成活率僅為6%；當裝載液處理時間為10 min時，莖尖成活率可達70%；而隨著裝載時間的進一步延長，處理10 min的成活率與處理20、40 min的結果沒有顯著性差異，因此裝載液最佳處理時間為10 min。

2.5　PVS2溶液處理時間對超低溫保存后莖尖成活率的影響

PVS2溶液具有良好的脫水效果，它可以緩慢滲入植物材料，使植物組織脫去水分呈玻璃化狀態，從而在超低溫環境下保護植物細胞結構不受損害。但由于PVS2溶液中含有二甲基亞砜等有毒物質，會對植物組織造成損害，因此在對植物材料進行PVS2脫水處理時，須要嚴格控制處理時間。本次試驗將裝載液處理過的莖尖轉入裝有PVS2溶液的冷凍管中并于0 ℃環境下處理不同時間，莖尖成活率如圖5所示。當莖尖未經PVS2溶液處理直接投入液氮中保存后，莖尖在恢復培養時全部失活變白；當PVS2處理時間為60 min時，莖尖成活率最高可達73.3%，而當處理時間進一步延長至80 min時，成活率降低至50%。

2.6　卸載液處理時間對超低溫保存后莖尖成活率的影響

當莖尖從液氮中取出化凍后，為了避免PVS2溶液對莖尖造成二次毒害，所以應立即對莖尖進行洗滌。卸載液中高濃度的蔗糖有助于去除莖尖外部殘留的PVS2溶液，減少莖尖受到的毒害，提高成活率。試驗結果表明，當不經過卸載液處理的莖尖直接進行恢復培養時，莖尖全部死亡，說明莖尖外部仍有殘留的PVS2溶液；利用含1.2 mol/L蔗糖的MS鹽溶液對化凍后的莖尖洗滌10 min后，莖尖成活率可達80%以上，洗滌時間對莖尖成活率的影響不顯著(圖6)。

2.7　恢復培養基對超低溫保存后莖尖成活率的影響

經過卸載液洗滌后的莖尖應立即轉入預先配制的恢復培養基中進行培養，本試驗中共設置3種不同的恢復培養基。結果(表1)表明，莖尖在不添加激素的培養基中的成活率低于添加激素的培養基；此外還可以看出，在只添加6-BA的恢復培養基中，莖尖恢復效果優于添加6-BA和NAA的恢復培養基，由此可知6-BA對于超低溫保存后莖尖成活率具有顯著影響。

表1　恢復培養基對超低溫保存后莖尖成活率的影響

3　討論

莖尖的剝離是獲得莖尖超低溫保存材料的必經途徑。莖尖剝離時，莖尖長度直接影響莖尖超低溫保存后的成活率。試驗結果表明，長度為1～2、3～5 mm的莖尖超低溫保存后的成活率遠小于長度為2～3 mm的莖尖，這與王貞等在研究扶芳藤(Euonymusfortunei)莖尖玻璃化超低溫保存時的研究結果[10]一致。原因在于莖尖長度過小時雖然脫水程度徹底，但成活率低；而莖尖長度過長又會使細胞內殘留水分，進而在液氮中形成冰晶破壞細胞結構，影響最終成活率。由此可見，適當的莖尖長度是影響莖尖超低溫保存的重要因素之一。

莖尖預處理是為了提高莖尖對超低溫環境的耐受性。常見的預處理方式主要有低溫鍛煉和預培養。低溫鍛煉主要是針對莖尖取自無菌苗的試驗，由于本試驗中莖尖取自實生苗，所以僅對莖尖進行預培養。試驗結果表明，最佳的預培養方式為將莖尖投入蔗糖濃度為0.4 mol/L的MS鹽溶液中暗培養2 d。前人研究表明，預培養對提高植物材料超低溫保存的成活率具有很大的影響[11]。王貞等在研究扶芳藤莖尖玻璃化超低溫保存時對莖尖直接進行裝載液處理[10]，而韓麗在研究菊芋品種莖尖超低溫保存時用含有0.4 mol/L蔗糖的液體MS培養基預培養3 d，2種植物的莖尖超低溫保存后的效果均表現良好[8]，所以針對不同的植物是否需要莖尖預處理以及如何處理是因植物材料而異的。

裝載液處理是為了進一步降低細胞內自由水的含量，平衡細胞內外的滲透壓。本試驗采用含2 mol/L甘油和 0.4 mol/L 蔗糖的MS鹽溶液裝載10 min，結果表明，莖尖成活率為70%左右，而對于不經過裝載液處理的試驗組，莖尖最終全部死亡，由此可見，裝載階段對于桃葉衛矛莖尖超低溫保存具有顯著影響。

利用PVS2溶液對莖尖進行脫水處理是莖尖超低溫保存過程中的關鍵步驟。由于PVS2溶液中的二甲基亞砜(DMSO)既是一種滲透性保護劑，又存在一定的毒性作用，因此，探究PVS2溶液處理時間對超低溫保存后莖尖成活率的影響是必不可少的。Sakai等的研究表明，莖尖在0 ℃條件下與PVS2溶液接觸所受到的毒害要小于在25 ℃條件下所受毒害[5]，因此本試驗研究了0 ℃條件下利用PVS2溶液對桃葉衛矛莖尖處理不同時間，結果顯示，適當的PVS2溶液處理時間對超低溫保存后莖尖成活率影響較大，在0～60 min 內，隨著PVS2溶液處理時間的延長，莖尖成活率在逐漸升高，并在60 min時莖尖成活率達到最高；當處理時間進一步延長時，莖尖受到的毒性也在不斷增大，使得莖尖成活率開始下降。不同植物莖尖進行PVS2溶液脫水處理的時間也各有不同，如柑橘(CitrusreticulataBlanco)莖尖超低溫保存中PVS2處理時間為60 min[12]，另外菊花[13]和白苜蓿草(Trifoliumrepens)[14]經過PVS2處理15 min，歐洲板栗(Castaneasativa)經過PVS2處理120 min才能達到最高存活率[15]，Niino等認為處理時間與材料的大小也有關系[16]。

莖尖從液氮中取出并化凍，由于仍然處于PVS2溶液中，此時如果直接將莖尖接種在恢復培養基上，那么殘留的PVS2溶液會繼續對莖尖造成毒害。因此，須要使用卸載液對莖尖進行洗滌。本試驗研究了不同洗滌時間對莖尖成活率的影響，結果表明，對于桃葉衛矛莖尖最佳的洗滌方法為 25 ℃ 條件下用含1.2 mol/L蔗糖的MS鹽溶液洗滌10 min，莖尖成活率可達80%以上。石茹等研究發現的最佳洗滌方法為用含1.2 mol/L蔗糖的MS鹽溶液在20～25 ℃條件下洗滌2～3次，每次10 min。

將莖尖接種于培養基上進行恢復培養，是檢測莖尖超低溫保存效果的直接而高效的方法，而恢復培養的環境條件以及培養基的配方對于莖尖能否成活顯得尤為重要。在恢復培養的條件下，在試驗過程中發現當莖尖處于正常光照條件下時，全部變白死亡。因此參照矮牽牛(Petuniahybrida)莖尖超低溫保存恢復培養過程中的方法[17]，先將莖尖放入人工氣候箱中，25 ℃ 條件下暗培養7 d后，轉入正常光照條件下培養，7 d 后發現莖尖開始逐漸變綠。而對于恢復培養基的配方，本試驗共設置了3組培養基，試驗結果表明，莖尖在含有 1.0 mg/L 6-BA 的MS培養基上成活率較高，因此桃葉衛矛莖尖超低溫保存后恢復培養最佳方案為：在MS+1.0 mg/L 6-BA 培養基上暗培養7 d后轉入正常光照條件下進行培養。

4　結論

本研究建立了桃葉衛矛莖尖超低溫保存體系(圖7)。結果表明，桃葉衛矛莖尖超低溫保存中莖尖最適長度為2～3 mm；在預培養階段，預培養液中蔗糖最適濃度為 0.4 mol/L，最佳預處理時間為2 d；在裝載液處理階段，最佳裝載時間為10 min；在PVS2溶液處理階段，最佳處理時間為60 min；在卸載液處理階段，最佳處理時間為10 min；當莖尖洗滌完畢后應將其接種于6-BA 1.0 mg/L的MS培養基上進行恢復培養，培養環境為暗培養7 d后轉入正常光照下進行培養，莖尖成活率可達70%以上。隨后再利用莖尖組織培養體系將其培養成苗。

參考文獻：

[1]王君暉，黃純農. 玻璃化法──園藝作物莖尖和分生組織超低溫保存的新途徑──文獻綜述[J]. 園藝學報，1994(3)：277-282.

[2]Yakai H，Thinh N T，Kyesmu P M. Cryopreservation of vegetatively propagated tropical crops by vitrification[J]. Acta Hort，1998，461：485-490.

[3]Uragami A，Sakai A，Nagai M，et al. Survival of cultured cells and somatic embryos ofAsparagusofficinaliscryopreserved by vitrification[J]. Plant Cell Reports，1989，8(7)：418-421.

[4]Towill L E. Cryopreservation of isolated mint shoot tips by vitrification[J]. Plant Cell Reports，1990，9(4)：178-180.

[5]Sakai A，Kobayashi S，Oiyama A I. Survival by vitrification of nu-cellar cells of navel orange(Citrussinensisvar.brasiliensisTanaka)cooled to-196 ℃[J]. Journal of Plant Physiology，1991，137(4)：465-470.

[6]尹明華，徐志堅，章省琴，等. 江西山藥莖尖包埋玻璃化法超低溫保存及其遺傳穩定性檢測[J]. 浙江農業學報，2016(6)：984-991.

[7]張艷秋，屈連偉，蘇君偉，等. 菊花莖尖玻璃化法超低溫保存技術研究[J]. 北方園藝，2016(5)：128-132.

[8]韓麗. 菊芋品種莖尖超低溫保存研究[D]. 哈爾濱：東北林業大學，2014.

[9]Niino T，TashiroK，Suzuki M. Cryopreservation of in vitro grown shoot tipsof cherry and sweet cherry by one step vitrification[J]. Scientia Horticulturae，1997，70：155-163.

[10]王貞，高健洲，劉燕. 玻璃化保存扶芳藤莖尖再生苗夏季適應性研究[J]. 林業科學，2007(9)：150-154.

[11]Tskagi H，Tinh N，IslamOM，et al. Cryopreservation ofinvitro-grown shoot tipsof vitrification procedure[J]. Plant Cell Reports，1997，16：594-599.

[12]王子成，鄧秀新. 玻璃化法超低溫保存柑橘莖尖及植株再生[J]. 園藝學報，2001(4)：301-306.

[13]劉艷霞，劉灶長，林田，等. 菊花莖尖的玻璃化超低溫保存研究[J]. 植物遺傳資源學報，2009，10(2)：249-254.

[14]Yamada T，Sakai A，Matusumura T. Cryopreservation of apical meristems of white clover[J]. Plant Science，1991(78)：81-87.

[15]Vidal N，Sánchez C，Jorquera L，et al. Cryopreservation of chestnut by vitrification ofinvitro-grown shoot tips[J].InVitroCellular & Developmental Biology-Plant，2005，41(1)：63-68.

[16]Niino T，Sakai A，Yakuwa H，et al. Cryopreservation ofinvitro-grown shoot tips of apple and pear by vitrefication[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1992，28：261-266.

[17]黃斌. 超低溫技術保存矮牽牛種質資源的研究[D]. 福州：福建農林大學，2012.