大蒜內生菌的分離及拮抗菌株的篩選與鑒定

李樂溪， 李　丹， 張　亮， 王軍娟， 楊緒勤， 蔣繼宏

(江蘇師范大學生命科學學院/江蘇省藥食植物生物技術國家重點實驗室培育點，江蘇徐州 221116)

植物內生菌普遍存在于植物組織內部，既能與宿主植物保持良好關系又不會引起宿主植物的病害，也不會改變宿主植物的表型特征和功能。內生菌來自于宿主植物，并能在植物體內發揮一系列生防功效。許多植物內生菌能產生豐富的次級代謝產物，而且具有多種生物活性，如殺菌、殺蟲、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化和促生長等[1-2]?；谀壳按罅康难芯?，植物內生菌顯示出了許多有益的生物學作用，因此植物內生菌作為一種新興的微生物資源成為了國內外研究的熱點。

植物病害，尤其是由病原真菌引起的病害，一直是農林業生產中的棘手問題，給人類造成了巨大的經濟損失。長期以來，人們認為用化學農藥解決植物病蟲害是最有效的辦法，但化學農藥也會帶來許多危害。目前，人工合成的化學農藥已有500余種，這些農藥的廣泛使用，不僅造成了嚴重的環境污染，也對人類以及動植物健康構成危害。然而，利用植物內生菌對植物病害進行生物防治的研究已相當普遍。何紅等從辣椒中分離篩選出2株內生枯草芽孢桿菌，研究表明這2株菌對辣椒、白菜、香蕉等植物炭疽病具有良好的防治效果[3-5]；吳海燕等研究了大豆根瘤內生菌次級代謝產物對大豆胞囊線蟲的抑制作用[6]；鄭愛萍等從水稻中分離獲得一株假單胞桿菌，并發現其對水稻紋枯病有防治作用[7]。隨著科學技術的不斷進步，研究開發生物農藥防治植物病蟲害的呼聲日益高漲，因此，開發利用植物內生菌的天然抗菌活性作為新型農藥具有巨大的潛力。

大蒜(AlliumsativumL.)，為百合科蔥屬多年生草本縮根植物。大蒜不僅是生活中常見的調味品，也是一種非常重要的藥用植物。大蒜的鱗莖中富含豐富的蛋白質、糖、維生素和礦物質，不僅能增強食欲、促進消化，而且根據研究表明，大蒜對多種細菌、真菌具有很強的殺傷、抑制作用，大蒜所含揮發性物質、大蒜汁及大蒜素對多種危害人體健康的病原菌有拮抗作用[8]，因此，大蒜被譽為“天然廣譜殺菌劑”，具有很高的經濟價值、營養價值和醫療保健價值，在各個方面有著廣泛應用。本研究以10種采集自全國不同地區的新鮮大蒜為樣品進行內生菌分離，共分離得到102株大蒜內生菌，通過抑菌活性試驗，從中篩選出具有拮抗作用的菌株，通過革蘭氏染色試驗、產生物被膜、淀粉酶活性和纖維素酶活性試驗，以期獲得大蒜內生菌的基本信息，為植物病蟲害的生物防治提供新的菌種資源。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1供試植物以10種采自江蘇徐州、山東金鄉、云南大理、湖南常德和甘肅隴南等不同地區的大蒜種植基地、農民菜園的新鮮大蒜為樣品。

1.1.2目標菌株茄鏈格孢(Alternariasolani)、辣椒枝孢(Cladosporiumcapsici)、稻梨孢菌(Pyriculariaoryzae)、白腐小核菌(sclerotiumcepivorum)、甘薯長喙殼菌(Ceratocystisfimbriata)、古巴假霜霉菌(Pseudoperonosporacubensis)、尖孢鐮刀菌西瓜專化型(Fusariumoxysporumf. sp.niveum)、蘋果輪紋病菌(Physalosporapiricola)、西瓜殼二孢(Ascochytacitrullina)。試驗所用植物病原真菌均由江蘇師范大學江蘇省藥食植物生物技術國家重點實驗室培育點提供。

1.1.3培養基分離和純化培養基均采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)、Luria-Bertani培養基(LB)和ISP培養基2號(ISP2)。①PDA固體培養基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，去離子水1 L，瓊脂20 g，pH值自然。②LB固體培養基配方：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母浸出粉5 g，去離子水 1 L，瓊脂20 g，pH值7.0～7.2。③ISP2固體培養基配方：葡萄糖4 g，酵母浸出粉4 g，麥芽浸膏粉10 g，瓊脂20 g，去離子水1 L，pH值7.0～7.2。④富集培養基為LB液體培養基，配方：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母浸出粉5 g，去離子水1 L，pH值7.0～7.2。⑤淀粉酶檢測培養基：可溶性淀粉10 g，硫酸鎂1 g，氯化鈉0.5 g，磷酸氫二鉀0.3 g，硝酸鉀1 g，瓊脂 20 g，去離子水1 L。⑥碘液的配制：碘片0.5 g，碘化鉀1 g，加入去離子水150 mL。⑦纖維素酶檢測培養基：磷酸氫二鉀0.3 g，硫酸鎂1 g，氯化鈉0.5 g，羧甲基纖維素鈉10 g，硝酸鉀1 g，酵母膏2 g，瓊脂20 g，去離子水1 L。

1.2　試驗方法

1.2.1大蒜內生菌的分離將新鮮大蒜去皮，用去離子水超聲振蕩10 min。無菌環境下用次氯酸鈉溶液浸泡5 min，75%乙醇漂洗20 s，無菌生理鹽水沖洗2次，無菌水沖洗1次，對大蒜進行表面消毒[9]。從最后一次沖洗的無菌水中吸取 100 μL 涂布在LB固體培養基上，37 ℃下培養1 d。證實無菌生長，再進行后續試驗。①組織切塊法：將經過表面消毒的大蒜樣品在無菌環境下切成0.5 cm3的組織塊，均勻嵌插在PDA培養基中，28 ℃下培養7～10 d。②組織勻漿法[10]：取10 g表面消毒后的大蒜樣品與無菌水25 g混合，研磨成蒜汁，靜置15 min。吸取蒜汁進行10倍梯度稀釋，得10-1、10-2、10-3濃度的組織液。分別從各梯度組織液中吸取 100 μL 涂布于PDA、LB、ISP2培養基上。PDA和ISP2平板放置于28 ℃培養箱培養7～10 d，LB平板放置于37 ℃培養箱培養7～10 d。分別從各分離平板上挑取菌落接種在新的純化培養基上，反復進行純化培養，直至獲得單一菌株并進行常規保種備用。

1.2.2抑菌活性篩選采用平板對峙法對大蒜內生菌的抑菌活性進行篩選，具體操作如下：用0.5 cm打孔器分別將9種植物病原真菌制成菌餅，挑取1塊病原菌菌餅放置在PDA平板中心，在距離病原菌菌餅2.5 cm處的6個點接種不同大蒜內生菌，另以不接種內生菌的平板做對照。放置于28 ℃下培養5～7 d，記錄抑菌圈大小并測量抑菌圈半徑。抑制率計算公式為：抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑)×100%[11]。

1.2.316S rRNA的PCR擴增[12]對篩選出的抑菌活性較高的菌株提取基因組DNA，采用16S rRNA全序列通用引物進行PCR擴增。產物測序后將16S rRNA全序列在https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi網站中進行Blast比對分析。系統發育樹采用Mega5軟件進行構建。

1.2.4拮抗菌的形態觀察及革蘭氏染色對篩選出的抑菌活性較好的菌株在LB培養基上采用四區劃線法劃出單菌落，記錄菌落的顏色、形狀等，通過顯微鏡觀察菌落特征。采用革蘭氏染色法[11]對有抑菌活性的內生細菌進行染色觀察。

1.2.5產生物被膜能力檢測將所有待測菌株挑取至LB液體培養基中，37 ℃搖床過夜培養。將1%的待測菌液在無菌的加樣槽中與新的LB液體混合；在無菌環境下用排槍吸取100 μL加入96孔板中，每株菌做8個重復；將96孔板四周用封口膜封口，于30 ℃下培養(細菌培養24 h，放線菌培養4～5 d)；檢測96孔板里菌液的吸光度D600 nm值，判定菌株的生長情況；將96孔板菌液倒掉，去離子水沖洗2遍；吸取 150 μL 結晶紫染液于96孔板中，染色15 min；用去離子水將染液沖洗干凈；200 μL 95%乙醇加入96孔板中，15 min后測定波長595 nm下的吸光度D595 nm，通過D595 nm評估菌株產生物被膜的能力。

1.2.6淀粉酶活性檢測將待測菌株點植在檢測培養基上，30 ℃培養4～5 d。向平板內加入碘液，使碘液剛好沒過培養基。10 min后傾倒碘液，用去離子水沖洗培養基表面進行脫色。根據菌落周圍是否有透明圈判斷菌株產淀粉酶的能力，記錄透明圈與菌落直徑。

1.2.7纖維素酶活性檢測將大蒜內生菌點植于檢測培養基，30 ℃培養4～5 d；向平板內加入0.5%剛果紅溶液，使其沒過培養基。染色10 min后傾倒干凈。向平板加入NaCl溶液(1 mol/L)進行脫色；觀察菌落四周有無透明圈產生，記錄透明圈與菌落直徑。

2　結果與分析

2.1　大蒜內生菌的分離結果

根據菌株的菌落大小、顏色、型態等特征，挑取分離平板上的單菌落進行純化，最終從10種來自不同地區的新鮮大蒜鱗莖中共分離得到細菌92株、真菌3株、放線菌7株(表1)。

表1　10個不同地區大蒜的內生菌分離數量比較

2.2　大蒜內生菌拮抗性分析

以茄鏈格孢、辣椒枝孢、大蒜白腐小核菌等9種植物病原真菌作為指示菌，對分離到的102株大蒜內生菌進行抑菌活性篩選(圖1)；通過16S rRNA對篩選出的菌株進行菌種鑒定，去除重復菌種后發現其中有19株內生菌對至少5種病原真菌有拮抗作用，如表2所示：KLBMPGC05、KLBMPGC26、KLBMPGC31、KLBMPGC67、KLBMPGC73、KLBMPGC81、KLBMPGC90能同時抑制9種病原菌。其中，菌株KLBMPGC90的拮抗性最強，對白腐小核菌的抑菌率達到 90.24%，對其他病原菌的抑制率均在70%上下。

2.3　大蒜內生菌的生理生化特征

對篩選出的19株大蒜內生菌進行革蘭氏染色、產生物被膜能力、淀粉酶活性和纖維素酶活性進行檢測，染色結果用“+”代表革蘭氏陽性、“-”代表革蘭氏陰性。19株大蒜內生菌產生物被膜、淀粉酶和纖維素酶的能力大小各不相同(表3、圖2、圖3)。

2.4　19株大蒜內生菌的分子鑒定

根據聚類結果，將擴增成功的PCR產物送至北京博邁德科技發展有限公司進行16S rRNA全序列測定，測序結果及其GenBank登錄號見表4。測序序列用Blast軟件與GenBank中已知的16S rRNA序列進行比對分析。選取若干同源性較高的參比菌株16S rRNA序列，構建系統發育樹(圖4)。

表2　內生細菌對9種病原真菌的抑菌率

表3　大蒜內生菌的生理生化特性

表4　供試菌株鑒定結果及其GenBank登錄號

3　結論與討論

本研究從采自10個不同地區、不同品種的大蒜蒜瓣中成功分離了大蒜內生菌。其中，以內生細菌的數量最多，說明細菌是大蒜內生菌的優勢菌，但大蒜中也存在真菌和放線菌這2種類型的菌。試驗所分離得到的多數內生細菌和內生放線菌對多種植物病原真菌具有廣譜抗性，且具有不同程度的產生物被膜能力和產酶能力。通過拮抗試驗的篩選，未發現有拮抗效果的大蒜內生真菌。

大蒜是人們喜愛的食品和調味品，是十分健康的食物，具有重要的保健意義。大蒜中含有眾多活性物質，一直以來研究人員將大蒜素、蒜氨酸等物質作為研究重點，在大蒜內生菌的領域進展較緩慢。人們自古以來就知道大蒜具有很強和廣譜的殺菌作用，有科學家試驗用大蒜汁來抑制和殺滅幾種常見的污染食品的真菌，結果發現大蒜抑制腐敗真菌的強度高于一些化學防腐劑，是自然界中殺菌作用最強的植物。因此，基于內生菌能夠產生與其宿主植物相類似的活性物質，具有與宿主植物相類似的功能，且很多植物內生細菌的抗菌活性普遍較高的理論[13-16]，本試驗成功驗證了大蒜內生細菌和內生放線菌能同時抑制多種植物病原真菌的生長。目前，在我國當今社會對加強生物農藥新產品研發、緩解農藥殘留帶來的環境污染問題的呼聲越來越高，這種植物內生菌“以菌治菌”的潛力將大大促進生物農藥的發展。我國自古以來就是一個農業大國，農業一直是國民經濟的命脈。發展生物農藥，以生物農藥替代化學農藥，不僅可以減少使用化學農藥時所帶來的環境破壞和對人類身體健康的危害，也可為我國農產品的生產創造十分有利的條件，極大地增強我國農產品的國際競爭力。由于在本試驗中可以看到大蒜內生菌具有較好的生防潛力[17]，下一步將通過更精確的篩選方法篩選出抑菌活性最強的菌株，進行盆栽試驗和大田試驗，來研究這些大蒜拮抗內生菌對植物病害的生防效果。

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