MaCaM和MaCAMTA3基因在熱處理誘導香蕉抗冷性中的作用

王海波， 李　璐， 蘇新國， 張昭其， 龐學群

(1.廣東食品藥品職業學院，廣東廣州 510520； 2.華南農業大學生命科學學院，廣東廣州 510642；3.華南農業大學園藝學院，廣東廣州 510642)

香蕉果實在貯藏溫度低于12 ℃時即發生冷害，難以采用較低的溫度來延長貯運期[1-2]。熱處理是提高果蔬抗冷性的最有效的采后處理措施之一[3]，但熱處理誘導的抗冷機制目前尚不明確。鈣調素(calmodulin，CaM)是植物中重要的第二信使，CAMTA(calmodulin-binding transcription activator)/SR (signal responsive transcription activator)是一類廣泛存在于真核生物中的含有CaM結合位點的轉錄因子家族。CaM和CAMTA在植物響應逆境中起調節作用，對香蕉CaM和CAMTA 的深入研究，有助于進一步了解香蕉鈣信號系統調節的分子機制，有助于揭示熱處理提高香蕉果實抗冷性的作用機理。CaM參與了植物對高溫、低溫脅迫等的響應，并且在植物細胞對脅迫的適應過程中起重要調節作用[4-5]。熱、冷、干旱等多種脅迫都能誘導CAMTA基因上調表達[6-7]。擬南芥CAMTA3能同CBF2(C-repeat binding transcription factor)啟動子區域CM2序列(CCGCGT)結合，激活CBF2等基因的表達，從而提高擬南芥的抗冷性[8]。筆者所在課題組的前期研究結果表明，采用52 ℃熱水處理香蕉果實3 min，能有效減輕香蕉果實的冷害癥狀[9-10]，但有關CaM和CAMTA在熱水處理誘導香蕉抗冷性中的作用目前還不明確。分析CaM和CAMTA基因在香蕉熱處理和低溫貯藏中的表達情況，探討這2個基因在熱處理誘導香蕉抗冷性中的作用，為有效延長香蕉貯運期提供參考依據。

1　材料與方法

1.1　試驗材料及處理

香蕉品種為巴西(Musaspp. AAAGroupcv.cavendish)，采自廣東省廣州市番禺香蕉園，及時運回廣東省果蔬保鮮重點實驗室。挑選七成飽滿、大小均勻、無病蟲害及機械損傷的單個香蕉， 先后用0.1%漂白粉和0.05%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑各浸泡5 min，晾干后備用。

熱水及低溫貯藏處理：將香蕉果實浸入熱水處理機(體積400 L)中，溫度52 ℃，時間3 min。熱水處理后將香蕉果實放入20 ℃恒溫箱中貯藏3 h，然后置于7 ℃下貯藏5 d；對照處理的香蕉在20 ℃恒溫箱中貯藏3 h，然后置于7 ℃下貯藏5 d。每個處理100個香蕉，定期取樣備用。取樣時間點為：20 ℃下0、0.5、1.5、3.0 h；7 ℃下1.0、4.0、8.0、24.0、48.0、120.0 h。

1.2　試驗方法

1.2.1脯氨酸含量測定參照Demiral等的試驗方法[11]，略有改動。取香蕉果皮0.5 g，用5 mL 3%磺基水楊酸提取，沸水浴10 min，冷卻。5 000 r/min離心10 min，取上清液待測。測定：取2 mL上清液，加2 mL水、2 mL 3%磺基水楊酸、2 mL冰乙酸和4 mL 2.5%茚三酮，沸水浴顯色30～60 min，冷卻。加4 mL甲苯萃取，靜置后取甲苯相測定520 nm下的吸光度(以甲苯為空白對照)。根據下式計算脯氨酸含量：單位鮮質量樣品中脯氨酸含量(μg/g)=2.5C/W，式中：C為樣品脯氨酸濃度，μg/mL；W為樣品質量，g；2.5表示溶液體積為 2.5 mL。

1.2.2實時定量引物設計根據已經克隆得到的MaCaM和MaCAMTA3基因序列，設計實時定量引物，驗證后備用。引物序列為MaCaM(5′-ACCGAAGCTGAGCTACAG-3′、5′-ATCCTTCATCTTGCGAGC-3′)和MaCAMTA3(5′-GCAA ATGGTCACAAAGGC-3′、5′-GAGAAGCATTCCGAACAG-3′)。

1.2.3實時熒光定量PCR(qRT-PCR)采用TOYOBO THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix 進行qRT- PCR擴增。反應體系為20.0 μL，即SYBR-Green PCR Master Mix 10.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.25 μL，稀釋的cDNA 2.0 μL，ddH2O 7.5 μL。擴增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40個循環。為了確認產物的質量和引物的特異性，在溶解曲線中分析產物的Tm(分析溶解溫度為65～95 ℃)。所有qRT-PCR結果根據內參基因Actin1進行Ct值校準，再利用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量，重復3次。

1.3　數據處理

采用Sigmaplot 12.5制作折線圖。

2　結果與分析

2.1　熱激處理及熱激后低溫貯藏對脯氨酸含量的影響

前期研究表明，7 ℃(冷害溫度)下，香蕉果實在處理后 5 d 已經出現明顯的冷害癥狀，利用52 ℃熱水處理(HWD) 3 min 能有效提高香蕉果實在7 ℃低溫貯藏中的抗冷性[9-11]。從圖1可知，對照香蕉果實的脯氨酸含量在7 ℃下呈現緩慢上升的趨勢。熱激處理后在20 ℃貯藏期間，香蕉果實的脯氨酸含量小幅度逐漸增加，且脯氨酸含量略高于對照。當熱激后的香蕉果實轉入7 ℃下1 h時，脯氨酸含量迅速增加至20 ℃貯藏時的3倍左右，之后呈現出下降上升再下降的趨勢，在整個7 ℃低溫貯藏期間，熱激處理的香蕉果實其脯氨酸含量一直明顯高于對照。

2.2　熱激處理及熱激后低溫貯藏對MaCaM表達的影響

從圖2可知，對照處理的MaCaM基因表達在7 ℃下1 h迅速升高至最大值，之后又在7 ℃ 4 h迅速下降，后期持續在同一個水平，但表達量仍高于20 ℃下的表達量。香蕉果實經過HWD處理后，MaCaM基因表達呈現快速升高的趨勢，在20 ℃下3 h達到一個高峰，MaCaM基因表達量約為對照的2倍。當熱激后的香蕉果實中轉入7 ℃低溫貯藏1 h時，MaCaM基因表達量迅速下降至0 d的水平，這與對照的表現相反。7 ℃低溫4～8 h時，MaCaM基因表達量迅速增強至最高峰，之后逐漸下降。除7 ℃貯藏1、4 h外，熱激處理的MaCaM基因表達量均高于對照。

2.3　熱激處理及熱激后低溫貯藏對MaCAMTA3表達的影響

從圖3可知，對照處理的MaCAMTA3基因在7 ℃貯藏下1～8 h呈現逐漸下降趨勢，7 ℃貯藏8～24 hMaCAMTA3基因表達又增強至20 ℃貯藏時的水平，之后又開始逐漸下降。香蕉經HWD處理后3 h，MaCAMTA3基因表達逐漸升高至最大值，約是對照處理的1.4倍，然而當果實轉入7 ℃后1 h，MaCAMTA3基因表達量出現短暫而迅速的下降，且低于對照。之后其表達量逐漸上升，在7 ℃ 8～24 h達到一個高峰，之后又開始逐漸下降。除7 ℃貯藏1、4 h外，HWD處理的MaCAMTA3基因表達均高于對照。

3　結論與討論

脯氨酸含量的積累與果實抗冷性的提高密切相關[12]。桃果實中較高的脯氨酸含量明顯提高了桃果實的抗冷性，而且用外源5 mmol/L脯氨酸處理桃果實，能明顯降低桃果實冷害指數，緩解其冷害癥狀的發生[13]。10 mmol/L甜菜堿處理可提高黃瓜果實中脯氨酸含量，從而減輕黃瓜果實貯藏期間的冷害[14]。外源NO處理能夠通過促進香蕉果實脯氨酸積累和增強體系的抗氧化性，進而減輕香蕉冷害[15]。本研究也發現，熱激能在處理后3 h內輕微增加香蕉果實脯氨酸的含量，而當果實經熱激處理后在7 ℃低溫貯藏時，其脯氨酸含量一直明顯高于對照處理，說明熱激誘導的脯氨酸大量積累與香蕉果實的抗冷性密切相關。

熱激處理能在短時間內迅速激活CaM的表達。例如，擬南芥幼苗經過37 ℃熱激后，其AtCaM3基因表達水平在 20 min 內迅速增加并達到最大值，在30 min后逐漸下降[16]。37 ℃處理玉米幼苗后，其CaM1-2的表達在10 min后開始迅速增強[4]，本研究也發現，香蕉果實經過熱激處理后，MaCaM基因表達呈現快速升高的趨勢，在處理后3 h達到一個高峰。CaM也參與了植物的低溫脅迫反應。例如，茶樹在4 ℃低溫脅迫下，CsCaM1與CsCaM2基因的表達量從3 h開始逐漸上升，于24 h達到最大值[17]。 4 ℃低溫能誘導小麥幼苗TaCaM5的表達量在1 h后迅速升高，3 h達到最高峰，之后又迅速下降至處理前的水平[18]。本研究結果與之類似，7 ℃ 低溫誘導香蕉果實的MaCaM基因表達在1 h迅速升高至最大值，之后又在4 h迅速下降，后期維持在一個較低的水平。而經熱激處理后在7 ℃低溫貯藏的香蕉果實，MaCaM基因表達高峰推遲出現在4 h，除低溫貯藏1、4 h外，熱激處理的MaCaM基因表達均高于對照。以上結果說明，MaCaM可能參與了熱激處理誘導香蕉果實抗冷性的過程。

熱處理和低溫都能誘導CAMTA基因的表達。42 ℃熱處理能誘導擬南芥幼苗的AtCAMTA1、AtCAMTA2、AtCAMTA3、AtCAMTA5、AtCAMTA6這5個基因在15 min開始上調表達，尤其是AtCAMTA1、AtCAMTA5、AtCAMTA6這3個基因在熱處理4 h內均維持較高的表達水平。類似地，4℃低溫也能誘導擬南芥幼苗AtCAMTA1、AtCAMTA2、AtCAMTA3、AtCAMTA5、AtCAMTA6這5個基因的上調表達，尤其是AtCAMTA1、AtCAMTA3、AtCAMTA5、AtCAMTA6這4個基因在低溫處理4 h內均保持較高的表達水平[6]。本研究也發現，熱處理能誘導香蕉果實MaCAMTA3基因表達在處理后3 h內迅速增強，7 ℃ 低溫貯藏下MaCAMTA3基因表達呈現先下降后上升再下降的趨勢，而經過熱激處理后在7 ℃低溫貯藏的香蕉果實，除低溫貯藏1、4 h外，MaCAMTA3基因表達均高于對照。說明熱激處理誘導MaCAMTA3基因較高的表達水平，可能參與了熱激處理誘導香蕉果實產生的抗冷性。

熱處理能誘導香蕉果實在低溫貯藏中的脯氨酸含量升高，從而提高果實抗冷性。MaCaM和MaCAMTA3基因可能參與了熱激處理誘導香蕉果實產生的抗冷性。

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