枇杷屬若干野生種葉片愈傷組織誘導和再分化

劉義存， 黃天啟， 林順權

(1.仲愷農業工程學院，廣東廣州 510225； 2.華南農業大學園藝學院，廣東廣州 510642)

枇杷屬(Eriobotrya)隸屬于薔薇科(Rosaceae)蘋果亞科(Maloideae)，原產于我國南方地區以及與我國西南毗鄰的東南亞幾個國家，共約有30余個種或變種。我國的野生枇杷種數約占世界的2/3，但根據多年來的調查發現，野生枇杷資源正逐漸減少[1-4]。從20世紀80年代開始，我國就開始了一些關于枇杷葉片細胞工程及離體培養的研究，如原生質體培養[5-7]、胚乳愈傷組織誘導[8]、葉片培養和愈傷組織誘導不定芽[9-11]。雖然不斷取得一些新進展，但迄今為止絕大多數報道都是關于栽培枇杷研究，而關于野生枇杷的葉片誘導愈傷組織、愈傷組織誘導再分化的系統研究還未見報道。為此，通過借鑒前人對普通枇杷葉片誘導愈傷組織的經驗，將研究建立相對可靠而普適的野生枇杷葉片離體培養誘導愈傷組織和再分化技術體系，旨在為枇杷屬栽培枇杷之外的各種枇杷種質資源離體保存、離體再生、細胞工程、轉基因等研究提供技術支持。

1　材料與方法

1.1　材料

以枇杷屬植物5個種、1個屬間雜種為試材(表1)，所有材料均來自華南農業大學枇杷屬種質資源圃。

1.2　方法

1.2.1葉片的接種從胚離體培養成功3個月后的試管苗中，以櫟葉枇杷、臺灣枇杷、臺灣枇杷恒春變型、南亞枇杷窄葉變型、香花枇杷和石斑木×臺灣枇杷等6個種的葉片為試材，在超凈工作臺上把無菌苗的葉片剪下來，切成約0.5 cm×0.5 cm 大小的葉塊，葉背朝下，接種在胚培養基上。暗培養10 d，再轉為24 h全光照，第20天統計愈傷率。隨后對愈傷組織進行再分化研究。

表1　試驗材料

1.2.2葉片的愈傷培養光照條件及不同生長調節劑對葉片誘導愈傷組織試驗的培養基本配方為：MS+(0、0.2 mg/L)6-BA+(0、0.2 mg/L)KT+(0、1.0、3.0、6.0 mg/L)2，4-D(單位下同)，并做接種后全光照培養和接種后10 d暗培養的對比試驗，選用材料為櫟葉枇杷。

不同濃度2，4-D對4種枇杷屬植物葉片誘導愈傷組織試驗的培養基本配方：MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT+(1.0、3.0、6.0 mg/L)2，4-D(單位下同)，并黑暗培養 10 d，選用材料為臺灣枇杷、臺灣枇杷恒春變型、南亞枇杷窄葉變型、香花枇杷。

枇杷屬植物與近緣屬植物交雜后代葉片誘導愈傷組織試驗培養基配方：MS+1.0 mg/L 6-BA+(0、0.1 mg/L)NAA，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+(0.1、0.8 mg/L)TDZ，MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L TDZ，MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L ZT，MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L 2IP，MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT+1.0 mg/L 2，4-D。選用材料為石斑木×臺灣枇杷。

1.2.3葉片愈傷組織的再分化不同生長調節劑對誘導葉片愈傷組織植株再生及生根試驗培養基配方：MS+1.0 mg/L 6-BA，MS+1.0 mg/L KT，MS+1.0 mg/L 2IP，MS+(1.0、2.0、3.0 mg/L)KT+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L 2，4-D，MS+(1.0，2.0、3.0 mg/L)ZT+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L 2，4-D，選用材料為臺灣枇杷。

不同生長調節劑對枇杷屬植物愈傷組織誘導胚狀體及生根的試驗培養基配方：MS+0.5 mg/L TDZ+(0、0.5、1.0 mg/L)KT，MS+0.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L 6-BA，MS+0.1 mg/L TDZ+1.0 mg/L 6-BA。選用材料為櫟葉枇杷。

以上試驗設置不同的試驗組合，每處理3個重復。培養環境條件：溫度(18±1) ℃，相對濕度65%～70%。本試驗數據用SPASS 11.0軟件進行方差分析，采用鄧肯氏新復極差測驗法進行平均數比較。

2　結果與分析

2.1　若干種枇杷屬植物葉片愈傷組織的誘導研究

2.1.1光照條件及不同生長調節劑對櫟葉枇杷葉片誘導愈傷組織的影響研究發現，單獨使用6-BA、KT、2，4-D的處理，櫟葉枇杷葉片愈傷率都相對比較低；特別單獨使用 2，4-D 的時候，愈傷率為0；而3種生長調節劑的組合處理愈傷率都比較高，差異顯著。在不同光照條件的處理中，10 d 的暗培養效果明顯，愈傷率平均達到57.78百分點，比全光照下的平均高17.78%。其中，0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT+1.0 mg/L 2，4-D組合經暗培養后，愈傷率達到100%，差異性顯著(表2，圖1-A1)。結果表明，隨著2，4-D濃度的升高，愈傷率產生下降趨勢，高濃度的2，4-D對櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導有抑制作用。

表2　光照條件及不同生長調節劑對櫟葉枇杷葉片誘導愈傷組織的影響

注：表中基本培養基為MS，植物生長調節劑的濃度單位為 mg/L。表中同列數值后不同字母表示0.05水平上差異顯著。下表同。

2.1.2不同濃度2，4-D對幾種枇杷屬植物葉片誘導愈傷組織的影響為了進一步驗證2，4-D的最適濃度，本試驗再以4種枇杷屬植物葉片(圖1-B1)為試材，并黑暗培養 10 d。研究發現，隨著2，4-D濃度的升高，愈傷組織的誘導率有下降的趨勢。在2，4-D濃度為 1.0 mg/L 時，臺灣枇杷(圖1-B2)、臺灣枇杷恒春變型和香花枇杷的愈傷率都達到100%；而南亞枇杷窄葉變型在所試的處理中愈傷率差異不顯著；臺灣枇杷愈傷率在所試的 2，4-D 濃度中均為100%(表3)。結合4個枇杷屬植物葉片愈傷的生長情況及顯著性分析，認為濃度為1.0、3.0 mg/L的2，4-D與6-BA、KT的組合配方適合枇杷屬植物葉片愈傷組織的誘導。但通過愈傷組織的整體外觀表現，濃度為 1.0 mg/L 的2，4-D愈傷組織更加有活力，與表2所得試驗結論一致。

表3　不同濃度2，4-D對4種枇杷屬植物葉片誘導愈傷組織的影響

注：每處理添加6-BA和KT濃度均為0.2 mg/L。

2.1.3枇杷屬植物與近緣屬植物交雜后代葉片誘導愈傷組織此次試驗材料為石斑木×臺灣枇杷雜交后代的葉片，因為石斑木屬于薔薇科蘋果亞科，是枇杷屬植物的近緣屬植物，與野生臺灣枇杷雜交的后代屬于種質創新。結合表3的試驗結果，進一步深化誘導的試驗。研究發現，當單獨使用6-BA時，無論是否加入生長素，石斑木×臺灣枇杷葉片愈傷率都不高，分別為0、4.16%；當6-BA與TDZ組合使用時，愈傷率顯著提高，并且隨著TDZ的濃度從0.1 mg/L升至0.8 mg/L時， 愈傷率也從 45.83%提高到87.53%。濃度為 0.5 mg/L的TDZ、ZT和2IP，分別與0.1 mg/L NAA進行單獨組合試驗，試驗統計得出TDZ愈傷率達到100%，ZT為 83.33%，2IP為91.67%，愈傷率差異不顯著；而0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT+1.0 mg/L 2，4-D的組合愈傷率為90.52%，與0.5 mg/L TDZ差異不顯著(表4)。結果表明，0.2 mg/L 6-BA、0.2 mg/L KT、1.0 mg/L 2，4-D的組合，對于無論是創新的雜交種，還是其他枇杷屬植物而言，都比較適合作為葉片愈傷誘導的通用配方；此外，0.5 mg/L TDZ和0.1 mg/L NAA也可以成為石斑木×臺灣枇杷雜交后代誘導愈傷組織的最佳組合。

表4　石斑木×臺灣枇杷葉片誘導愈傷組織的結果

2.2　枇杷屬2個野生種葉片愈傷組織誘導再分化

從以上試驗成功誘導的葉片愈傷組織中取臺灣枇杷和櫟葉枇杷的愈傷組織作為胚狀體誘導、分化芽苗和生根的試材。研究發現，在臺灣枇杷葉片愈傷組織的誘導再分化試驗中，雖然探索了各種各樣的培養基配方，但均尚未獲得成功，只能誘導部分愈傷組織分化生根，而不能分化芽苗(即地上部)。其中，1.0、2.0、3.0 mg/L KT與NAA、2，4-D的組合都能直接使葉片愈組織分化生根，生根率隨著KT濃度的增加而增加，生根分化率最高達20%。而在ZT與NAA、2，4-D的組合中，只有2.0 mg/L ZT能誘導少數葉片愈組織分化生根，生根誘導率為8.33%(表5)。

研究還發現，在櫟葉枇杷的愈傷組織誘導再分化試驗中，產生了胚狀體，同時少部分愈傷組織分化生根。添加TDZ都能使櫟葉枇杷愈傷組織誘導出胚狀體，但誘導率都比較低；KT比6-BA更適合愈傷組織誘導胚狀體(圖1-A2)。其中 0.5 mg/L KT和0.5 mg/L TDZ的組合使胚狀體誘導率最高，達21.43%，這也是唯一同時能使愈傷分化產生根的組合(圖1-A3 至圖1-A5)，生根率為7.14%。

表5　不同生長調節劑對誘導臺灣枇杷葉片愈傷組織植株再生及生根的影響

表6　不同生長調節劑對櫟葉枇杷愈傷組織誘導胚狀體及生根的影響

注：每處理添加NAA濃度圴為：0.1 mg/L。

3　討論與結論

關于枇杷屬植物野生種的研究報道，近10年來才慢慢地變得多些[1-3]，但還是不夠，特別是野生種質資源在生物技術等方面的運用和開發[4，12-15]。枇杷屬植物野生種的報道少，首先這些種質資源不多，收集難度大，即使收集到的種質資源，進行離體保存研究的也很少。可能由于野生種之間以及普通栽培種之間，在形態、生理和遺傳等方面存在的差異，所以在研究過程度中，盡管借鑒前人在栽培枇杷細胞工程研究中的方法技術，但還是碰到了許多困難，例如，本研究表明，不同種之間結果差異性較大，從而導致本試驗結果看起來不是很完整和統一。

在枇杷屬植物野生種的葉片愈傷組織誘導的研究結果中，以1.0、3.0 mg/L 2，4-D與0.2 mg/L 6-BA、0.2 mg/L KT的組合配方，對香花枇杷、臺灣枇杷、臺灣枇杷恒春變型、櫟葉枇杷、南亞枇杷窄葉變型和石斑木×臺灣枇杷等6個種的葉片進行培養，誘導出愈傷組織，其中有5個種的愈傷誘導率達到了100%。經過大量試驗驗證枇杷屬植物野生種的葉片誘導愈傷組織最佳的誘導條件為：在18 ℃下暗培養10 d后再轉至全光照，培養基配方為MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT+1.0 mg/L 2，4-D。另外枇杷屬植物與近緣屬植物交雜后代葉片誘導愈傷組織的結果顯示，屬間雜種后代材料葉片愈傷的誘導既有其他枇杷屬野生種的共性，也有本身的一些特性，如0.5 mg/L TDZ和0.1 mg/L NAA是誘導石斑木×臺灣枇杷葉片愈傷組織的最佳組合之一。本試驗還做了溫度對枇杷愈傷組織誘導的試驗，發現無論是溫度18、22 ℃ 還是25 ℃，其愈傷誘導率差異性不顯著，但 18 ℃ 下的試驗愈傷組織的外觀表現為黃綠色更有活力，容易擴繁，其他溫度下的愈傷組織為青綠色、粉紅色或白色，不容易擴繁。

在對枇杷屬植物野生種葉片愈傷組織誘導再分化的試驗中，雖然誘導出了胚狀體和根，但誘導率不高，未能分化出完整芽苗或植株，培養條件還得繼續試驗優化。筆者也對其他野生種如臺灣枇杷恒春變型、南亞枇杷窄葉變型、香花枇杷和石斑木×臺灣枇杷同樣做了愈傷組織誘導再分化的試驗，但都未能成功，說明野生種枇杷的葉片愈傷組織比較難誘導再分化，還須要再做大量的試驗進行探索研究。

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